晚期非小細胞肺癌血液ALK基因重排檢測技術研究進展

祝行琴

（浙江大學醫學院附屬第二醫院 浙江 杭州 310008）

肺癌是我國發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，大多患者確診時已屬晚期，喪失了手術治療的機會，因此放化療和靶向治療是晚期非小細胞肺癌治療的主要方式。EML4-ALK基因重排是非小細胞肺癌靶向治療的有效靶點之一，約5%患者攜帶有EML4-ALK基因重排，特別是非吸煙患者，突變率可達17%，該類患者可以從靶向ALK激酶的酪氨酸激酶抑制劑中獲益[1,2]。目前，常規的EML4-ALK基因重排的檢測方法是基于組織標本的免疫組化法、熒光原位雜交法、rt-PCR法以及高通量測序法[3,4]。然而存在部分晚期非小細胞肺癌患者無法進行組織活檢，因此基于血液標本的液體活檢技術給這類患者帶來了新的希望，但血液ALK重排檢測相對于EGFR基因檢測難度更大。下文對現階段血液ALK基因重排的檢測技術進行綜述，以促進晚期NSCLC患者ALK重排檢測的普及。

1.循環腫瘤細胞技術檢測ALK基因重排

近年來，研究表明循環腫瘤細胞也能用于EML4-ALK重排檢測，并且多個研究結果顯示，循環腫瘤細胞中EML4-ALK重排的檢測結果與組織活檢標本中的檢測結果具有較高的符合率[5,6]。2012年，Hofman, V.等人使用ISET技術（Isolation by size of epithelial tumour cell），根據循環腫瘤細胞直徑比正常血液細胞大的特征，使用特定尺寸的微孔濾膜將循環腫瘤細胞與血液細胞分離，直徑較大的循環腫瘤細胞留在濾膜上。微孔濾膜過濾技術的優勢在于分離出的循環腫瘤細胞可以同時被用于下游的細胞形態學研究，因此可以通過一定的形態學判讀標準將分離出來的細胞進行更精準地分類[7]，此外，這種技術捕獲的循環腫瘤細胞也能用于下游免疫細胞化學或熒光原位雜交檢測。但是，這種方法的缺點在于很多患者常常僅能分離出不到100個循環腫瘤細胞，這就限制了判讀的陽性閾值。

2.血漿RNA檢測ALK重排

血漿循環游離DNA已經較常規地被用于晚期非小細胞肺癌患者EGFR基因的突變檢測，然而血漿游離RNA卻并未被常規用于EML4-ALK重排的檢測，究其原因主要在于血漿RNA在抽血采樣后降解非常迅速，臨床上很難控制采血后能否及時地進行血漿RNA的分離和檢測，此外，血漿RNA中EML4-ALK的含量也較低，RT-PCR的最低檢測限也很難滿足常規的EML4-ALK檢測，因此限制了血漿RNA的臨床應用。

3.血小板檢測ALK重排

近年來多個研究發現血小板的微囊泡結構可以較好地將腫瘤RNA進行隔離保護[8,9]。腫瘤來源的血小板可以被用于富集腫瘤RNA進行EML4-ALK重排的檢測。有研究顯示血小板檢測EML4-ALK比血漿RNA檢測具有更高的特異性和敏感性，并且，在克唑替尼治療的患者中血小板EML4-ALK的存在預示著腫瘤的進展與不良的預后[10]，此外，血小板中EML4-ALK的再現是克唑替尼耐藥的一個標志，這種現象往往比影像學的進展提早了幾個月的時間。

4.二代測序技術檢測ALK重排

在晚期肺癌中，除了ALK重排外，其他基因重排例如ROS1、RET、NTRK等也同樣被發現與靶向治療相關，總體的突變率約為1-2%左右。因此，二代測序技術近年來被不斷地開發用于同時從血漿游離DNA中檢測這些基因組的異常[11,12]?；陔s交捕獲建庫，二代測序技術能同時檢測到基因重排、點突變、插入缺失、拷貝數變異等，但目前為止在血漿游離核酸標本中該技術檢測ALK基因重排的敏感性相對于組織標本來說還較低，在常規應用于臨床之前還需要進一步的技術改進。

5.液體活檢檢測ALK重排的優缺點

與EGFR液體活檢檢測優缺點相似，ALK基因重排液體活檢具有下列優勢：（1）液體活檢為非侵入性的檢測，具有無創或微創的特點，因此可以進行重復檢測，可以作為組織活檢的有效補充。例如當患者無法進行活檢手術或活檢組織不適合進行基因檢測時（腫瘤細胞太少、非正常福爾馬林固定、組織大面積壞死等）可以首先進行液體活檢檢測；（2）監測靶向治療療效與腫瘤進展。液體活檢在靶向治療療效監測中的應用相對于組織活檢具有較顯著的優勢。晚期肺癌患者可以在不同時間點進行多次液體活檢，以反映克唑替尼靶向治療后疾病的進展情況。值得一提的是液體活檢技術可以在影像學進展之前數月檢測到耐藥突變的產生，可以為臨床治療方案的調整提供依據。然而，ALK重排的液體活檢也存在不少的問題有待解決。首先是ALK重排的液體活檢技術目前還不是臨床的常規應用技術，因此其重復性較大程度依賴于實驗操作的熟練度。其次，循環腫瘤細胞的捕獲技術也還未在臨床普遍開展，因此并非每個醫療機構都能采用該技術。此外，上述技術對臨床外周血采樣后的血漿、血小板分離時效性要求較高，不合理的管理和操作均會顯著影響ALK重排的檢測結果。最后不能忽視的一個問題是患者個體間無論是循環腫瘤細胞還是游離核酸差異非常大，這取決于患者的腫瘤生物學特性，甚至在部分已經發生遠處轉移的患者中依然僅存在極少量的循環腫瘤細胞或游離腫瘤核酸，并且，對于二代測序技術來說，一管10毫升的外周血中所分離到的循環腫瘤DNA往往不足以進行一次檢測。

6.總結與展望

液體活檢技術可以檢測ALK基因重排，包括循環腫瘤細胞、血漿和血小板，都具有較高的特異性，但敏感性差異較大，綜合應用上述液體活檢技術將有助于提高ALK重排的檢出率。液體活檢檢測ALK重排的優勢與EGFR基因突變的液體活檢類似，具備以下主要優勢：（1）在無法獲取活檢組織時可以一定程度補充ALK基因重排的信息；（2）可以用于ALK基因耐藥突變的早期監測；（3）可以用于靶向治療的療效監測。綜上所述，目前液體活檢最大的挑戰在于如何提高檢測的敏感性以及如何優化二代測序技術用于全面地檢測EGFR突變、ALK融合、ROS1融合、RET融合、NTKR融合等以及其他相關基因例如BRAF、HER2、Met等突變并且評估微衛星穩定性。這需要提高標本的管理響應水平以及提高現有技術的敏感性。

[1]Barlesi F, Mazieres J, Merlio JP, Debieuvre D, Mosser J,Lena H, et al. Routine molecular profiling of patients with advanced non-small-cell lung cancer： results of a 1-year nationwide programme of the French Cooperative Thoracic Intergroup (IFCT). Lancet. 2016;387：1415-26.

[2]Le T, Gerber DE. ALK alterations and inhibition in lung cancer. Seminars in cancer biology. 2017;42：81-8.

[3]Kerr KM, Lopez-Rios F. Precision medicine in NSCLC and pathology： how does ALK fit in the pathway? Ann Oncol.2016;27：16-24.

[4]Yatabe Y. ALK FISH and IHC You Cannot Have One without the Other. Journal Of Thoracic Oncology. 2015;10：548-50.

[5]Aieta M, Facchinetti A, De Faveri S, Manicone M, Tartarone A, Possidente L, et al. Monitoring and Characterization of Circulating Tumor Cells (CTCs) in a Patient With EML4-ALK-Positive Non-Small Cell Lung Cancer(NSCLC). Clinical lung cancer. 2016;17：e173-e7.

[6]Tan CL, Lim TH, Lim TKH, Tan DSW, Chua YW, Ang MK, et al.Concordance of anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene rearrangements between circulating tumor cells and tumor in non-small cell lung cancer. Oncotarget. 2016;7：23251-62.

[7]Hofman V, Long E, Ilie M, Bonnetaud C, Vignaud JM, Flejou JF, et al. Morphological analysis of circulating tumour cells in patients undergoing surgery for non-small cell lung carcinoma using the isolation by size of epithelial tumour cell (ISET) method. Cytopathology ： official journal of the British Society for Clinical Cytology. 2012;23：30-8.

[8]Best MG, Sol N, Kooi I, Tannous J, Westerman BA,Rustenburg F, et al. RNA-Seq of Tumor-Educated Platelets Enables Blood-Based Pan-Cancer, Multiclass, and Molecular Pathway Cancer Diagnostics. Cancer Cell. 2015;28：666-76.

[9]Nilsson RJ, Balaj L, Hulleman E, van Rijn S, Pegtel DM,Walraven M, et al. Blood platelets contain tumor-derived RNA biomarkers. Blood. 2011;118：3680-3.

[10]Nilsson RJ, Karachaliou N, Berenguer J, Gimenez-Capitan A, Schellen P, Teixido C, et al. Rearranged EML4-ALK fusion transcripts sequester in circulating blood platelets and enable blood-based crizotinib response monitoring in nonsmall-cell lung cancer. Oncotarget. 2016;7：1066-75.

[11]Newman AM, Bratman SV, To J, Wynne JF, Eclov NC,Modlin LA, et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Med.2014;20：548-54.

[12]Cui SH, Zhang W, Xiong LW, Pan F, Niu YJ, Chu TQ, et al. Use of capture-based next-generation sequencing to detect ALK fusion in plasma cell-free DNA of patients with non-small-cell lung cancer. Oncotarget. 2017;8：2771-80.