126例子宮內膜癌中Lynch綜合征的初步篩查

楊通印，易 韋，褚明亮，張著學，林永順

126例子宮內膜癌中Lynch綜合征的初步篩查

楊通印，易 韋，褚明亮，張著學，林永順

目的 探討hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2蛋白缺失情況和hMLH1基因啟動子甲基化狀態及Lynch綜合征患者的家系分析，初步進行Lynch綜合征相關子宮內膜癌篩查。方法 采用免疫組化SP法檢測126例子宮內膜癌中hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2蛋白表達，并用甲基化特異性PCR檢測hMLH1蛋白表達缺失病例的hMLH1基因啟動子甲基化狀態。結果 免疫組化結果顯示22%(28/126)的病例出現MMR蛋白缺失表達，其中12例hMLH1-/hPMS2-、6例hPMS2-、4例hMSH2-/hMSH6-，hMSH6-和hMLH1-各3例，以hMLH1和hPMS2蛋白缺失表達為主。甲基化特異性PCR檢測有hMLH1蛋白表達缺失的15例子宮內膜癌中hMLH1基因啟動子甲基化狀態，證實9例存在hMLH1基因啟動子甲基化，提示其為子宮內膜癌的散發性病例。結論 對子宮內膜癌患者行MMR蛋白免疫組化SP法染色，結合甲基化特異性PCR檢測hMLH1基因啟動子甲基化狀態，是初步篩查Lynch綜合征的有效策略。

子宮內膜腫瘤；Lynch綜合征；錯配修復基因；免疫組織化學

Lynch綜合征是一種由堿基錯配修復(mismatch repair, MMR)基因缺陷引起的常染色體顯性遺傳病，具有較高的癌癥傾向。腫瘤的發生主要與hMSH2、hMSH6、hMLH1及hPMS2的DNA MMR基因胚系突變有關。在女性Lynch綜合征患者中，惡性腫瘤的高發部位主要為子宮內膜，稱之為Lynch綜合征相關子宮內膜癌，MMR基因的種系突變決定該病的診斷，Lynch綜合征相關子宮內膜癌占子宮內膜癌的比率較少(<5%)[1]。目前，診斷Lynch綜合征相關性子宮內膜癌的最可靠方法是分析四種常見的MMR基因，即應用hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2基因的胚系突變來診斷Lynch綜合征[2]。由于MMR基因突變的異質性，突變分析花費高、費時費力，且預期的陽性率較低；因此對高危患者在進行MMR基因突變分析前進行預篩查非常重要。本文著重探討四種常見的MMR基因在Lynch綜合征相關子宮內膜癌中篩查的有效性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集貴州省人民醫院2013年1月1日～2015年6月30日確診為子宮內膜癌標本126例，其中包括子宮內膜樣癌82例、21例漿液性癌、14例透明細胞癌及9例肉瘤樣癌。

1.2 主要試劑 兔抗人hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2抗體購自北京中杉金橋公司，工作濃度為1 ∶50；SP試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。DNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，甲基化修飾試劑盒及甲基化陽性(陰性)對照均購自美國ZYMO公司，甲基化特異性PCR反應試劑ROX購自日本TaKaPa公司，Mix購自上海輝睿生物公司。核酸蛋白質濃度測量儀B-500購自上海創萌生物公司，Mx3000P定量PCR擴增儀購自美國Stratagene公司。

1.3 HE及免疫組化染色 新鮮標本均用10%中性福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，常規HE染色及免疫組化SP法染色。免疫組化SP法染色主要操作步驟：切片脫蠟水化，經3%H2O2溶液37 ℃水浴浸泡20 min；經高壓鍋加熱煮沸4 min，冷卻至室溫；正常羊血清封閉，37 ℃水浴浸泡15 min；滴加一抗，4 ℃過夜，37 ℃ 1 h；滴加二抗，37 ℃水浴放置30 min；加入辣根過氧化物酶，37 ℃水浴放置30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色6～8 min，蘇木精復染，常規脫水、透明、封固。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷 hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2蛋白在癌細胞的表達，細胞核被染成強弱不等的棕黃色，出現全核著色、核異質性或亞克隆性著色(癌細胞巢中呈核著色或無著色)和全核無著色的3種表達模式[3-4]；以全細胞核不著色判斷為陰性，另2種為陽性。

1.5 基因組DNA提取 按照TIANGEN組織DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取，提取后經紫外分光光度計法檢測DNA的濃度及純度，-20 ℃條件下保存備用。

1.6 DNA亞硫酸氫鈉修飾及純化回收 按照EZDNA Methylation-GoldTM kit試劑盒(D5005)說明書的操作要求對DNA進行修飾及純化，回收純化的DNA。

1.7 甲基化特異性PCR 取修飾后的DNA進行PCR擴增反應，具體步驟參照試劑盒說明書進行。hMLH1甲基化及非甲基化引物：反應總體積25 μL，上、下游引物各1 μL，已修飾的DNA模板2 μL，10×Buffer 3 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，TransTaqTMHiFi DNA Polymerase 0.3 μL，ddH2O 15.7 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性7 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 8 s，合計40個循環，最后72 ℃延伸1 min。取擴增后的PCR產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析儀觀察并分析結果、拍照。

1.8 家系分析 以MMR蛋白表達丟失的結直腸癌患者為核心繪出家系圖，并用系譜分析法確認每個家系的遺傳方式，盡可能獲得每例患者詳盡的臨床及病理學資料。以AmsterdamⅡ標準和中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)家系篩檢標準，了解不同篩檢標準間的差異。AmsterdamⅡ標準：(1)家族中至少有兩代垂直傳遞的結直腸癌；(2)家族中至少有3名或3名以上成員經病理證實為結直腸癌或相關惡性腫瘤；(3)家族中至少有一名結直腸癌患者發病年齡小于50歲。中國人HNPCC家系篩檢標準：家系中至少有2例組織學證實的結直腸癌患者，其中2例為父母與子女或同胞兄弟姐妹的關系，且符合以下任一條：至少1例為多原發結直腸癌者(包括腺瘤)；至少1例結直腸癌發病早于50歲；家系中至少1例患HNPCC相關腸外惡性腫瘤(胃、子宮內膜癌、小腸癌、腎盂輸尿管癌、卵巢癌、肝膽系統癌)。

1.9 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMR蛋白在子宮內膜癌中的表達 hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2蛋白表達定位于細胞核，細胞核被染成淺棕色至深棕色；細胞核全著色、異質性或亞克隆性著色，為MMR蛋白表達；若細胞核全無著色，則為MMR蛋白表達缺失(圖1～4)。126例子宮內膜癌中hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2蛋白表達結果顯示22%(28/126))的病例出現MMR蛋白表達缺失，其中12例hMLH1-/hPMS2-、6例hPMS2-、4例hMSH2-/hMSH6-，hMSH6-和hMLH1-各3例，以hMLH1和hPMS2蛋白表達缺失為主，其中15例hMLH1蛋白表達缺失。

2.2 甲基化特異性PCR檢測 15例hMLH1蛋白表達缺失患者中9例有hMLH1基因甲基化(圖5)，提示其為散發性子宮內膜癌。余下的19例可能存在MMR基因的胚系突變。

2.3 MMR蛋白表達缺失與子宮內膜癌臨床病理特征的關系 MMR蛋白表達缺失多數為60歲以下患者，發生在子宮下段居多，且多數有豐富的淋巴細胞浸潤(P<0.05)；MMR蛋白表達缺失與子宮內膜癌的組織學類型、淋巴結轉移、TNM分期無關(P>0.05，表1)。

表1 MMR蛋白表達缺失與子宮內膜癌臨床病理特征的關系

2.4 家系分析 19例MMR蛋白缺失患者中，符合AmsterdamⅡ標準的家系有3例，2例為hMLH1-/hPMS2-，1例為hMSH2-/hMSH6-。符合中國人HNPCC家系篩檢標準的家系有5例，1例為hMLH1-，2例為hMLH1-/hPMS2-，2例為hMSH2-/hMSH6-。按中國人HNPCC家系篩檢標準，可確診5例為Lynch綜合征相關的子宮內膜癌，最后余下的14例為高危MMR基因突變患者，可進行MMR基因的胚系突變分析確定是否為Lynch綜合征相關的子宮內膜癌，且最大程度縮小高昂費用的MMR基因突變分析的檢測病例數。

圖1 MMR蛋白在同一例子宮內膜樣腺癌中的表達,SP法:A.胞核呈棕黃色;B.胞核不著色,散在淋巴細胞和間質細胞陽性 圖2 MMR蛋白在同一例子宮低級別漿液性腺癌中的表達,SP法:A.胞核呈棕黃色;B.胞核不著色散在淋巴細胞和間質細胞陽性 圖3 MMR蛋白在同一例子宮透明細胞癌中的表達,SP法:A.胞核呈棕黃色;B.胞核不著色,散在淋巴細胞和間質細胞陽性 圖4 MMR蛋白在同一例子宮肉瘤樣癌中的表達，SP法：A.胞核呈棕黃色；B.胞核不著色，散在淋巴細胞和間質細胞陽性

圖5 子宮內膜癌組織hMLH1基因甲基化結果

P.陽性對照；M.甲基化條帶；U.非甲基化條帶；1～15.hMLH1蛋白表達陰性標本

3 討論

Lynch綜合征是一種由MMR基因缺陷引起的常染色體顯性遺傳病，具有較高的癌癥發生傾向。腫瘤的發生主要與4種MMR基因的胚系突變有關，即hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2。該病患者首先遺傳了MMR突變基因，從而獲得腫瘤易感性，隨后另一等位基因后天獲得性異常，則DNA復制錯誤無法恢復進而發生腫瘤，且患者可同時或異時發生多種腫瘤，子宮內膜和結直腸是最常發生腫瘤的部位[5]。發生在子宮內膜的腫瘤稱為Lynch綜合征相關的子宮內膜癌，在遺傳學上特征表現為MMR基因的胚系突變，致使hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2等蛋白1種或多種表達缺失。利用特異性抗體通過免疫組化檢測hMSH2、hMSH6、hMLH1和hPMS2蛋白表達，能預測引起MMR蛋白表達缺失的基因突變(如無義突變、移碼突變、大的基因組片段重排等)，其敏感度較高[6]。然而，并不是所有的MMR蛋白表達缺失均由MMR基因突變引起，hMLH1基因啟動子的過度甲基化也可引起MMR蛋白表達缺失[7]，且并不是所有的基因突變均引起MMR蛋白表達缺失，因此對免疫組化法檢測結果的解釋應謹慎。MMR蛋白的表達只能用來篩選Lynch綜合征，并不是一項診斷性檢驗。子宮內膜癌出現MMR蛋白表達缺失多見于兩種情況：(1)散發性子宮內膜癌發生甲基化表觀遺傳學改變，即hMLH1基因啟動子超甲基化導致基因沉默發生hMLH1蛋白表達缺失，甚至hPMS2蛋白表達缺失；(2)Lynch綜合征患者出現MMR基因的胚系突變，致hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2中的1個或多個蛋白表達缺失。本組應用國外普遍公認的篩查方法——免疫組化法[8]，檢測126例子宮內膜癌，有28例出現hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2蛋白表達缺失，缺失率為22%(28/126)，遠高于實際Lynch綜合征相關的子宮內膜癌所占子宮內膜癌的比率(<5%)，但明顯排除不是Lynch綜合征相關子宮內膜癌的患者。28例中有MMR蛋白表達缺失的病例中，hMLH1蛋白表達缺失的有15例，通過甲基化特異性PCR檢測，發現9例有hMLH1基因甲基化，提示其為散發性子宮內膜癌，余下的19例可能存在MMR基因的胚系突變。獲取19例患者的詳細病史，再應用中國人HNPCC家系篩檢標準評判，明確5例為Lynch綜合征相關的子宮內膜癌，剩下14例通過MMR基因胚系突變分析，明確是否可診斷Lynch綜合征相關的子宮內膜癌，最大程度地明確高危Lynch綜合征相關子宮內膜癌患者人群，縮小了費用高昂、費時費力的MMR基因胚系突變分析的檢測范圍。

本實驗與既往報道Lynch綜合征相關子宮內膜癌特征性的臨床病理結果一致[9-10]，如發病年齡多低于60歲，高發于子宮上段，腫瘤間質見較多淋巴細胞反應，差異有統計學意義。腫瘤在組織學上具有多形性，即Ⅰ型(子宮內膜樣癌)和Ⅱ型(包括透明細胞癌、漿液性癌、未分化癌/癌肉瘤)子宮內膜癌。本實驗收集126例子宮內膜癌均包含上述亞型，并分為4組，實驗發現每種類型子宮內膜癌均出現MMR蛋白的表達缺失；腫瘤在組織學上具有異質性，收集的病例中由子宮內膜樣腺癌與漿液性腺癌組成的混合性癌1例和漿液性腺癌與透明細胞癌組成的混合性癌1例，但未出現MMR蛋白表達缺失。本實驗發現MMR蛋白表達缺失在多形性和異質性的子宮內膜癌病例中表達差異無統計學意義，即四種子宮內膜癌的表達缺失率差異無統計學意義；也可能由于各類腫瘤病例數均較少，以期收集更多病例進一步分析。

Lynch綜合征家族是MMR基因突變的攜帶者，其女性發生子宮內膜癌的概率為60%，其子女發生突變的概率為50%，且發病年齡早，平均46.4歲[11-13]；Lynch綜合征相關子宮內膜癌患者初次發病后，10年內再次患癌率為25%，15年內再次患癌率50%[14]。因此，篩查Lynch綜合征家族具有重要意義。國外多數腫瘤中心已開始應用免疫組化檢測所有子宮內膜癌的MMR蛋白表達情況[15]，對Lynch綜合征家族進行篩查，最終通過基因測序檢測MMR基因胚系突變情況，確診Lynch綜合征家族。有學者[16]建議對確診為遺傳性MMR突變攜帶者進行終生隨訪，一旦發現結直腸腺瘤及時行摘除術，從而預防結直腸癌的發生。男性攜帶者應從25歲開始，每兩年行腸鏡檢查1次，35歲后改為每年1次，直至70歲。女性攜帶者應從30歲開始，每年行1次HE4及CA125檢測、婦科檢查及陰道超聲檢查，必要時行陰道鏡檢查和子宮內膜活檢。

Lynch綜合征相關子宮內膜癌有發病率高、發病時間早等臨床特點。發病初期應重視Lynch綜合征相關的子宮內膜癌女性婦科癌癥的篩查和臨床預防工作，采取預防婦科手術能有效防止Lynch綜合征相關婦科腫瘤的發生。臨床醫師和患者應根據手術的益處、風險、不良反應以及腫瘤篩查的有效性等方面綜合分析做出決策。我國人口基數大、患病人數多，但Lynch綜合征相關子宮內膜癌家庭的報道較少，遺傳測試仍在試驗階段，戶籍和跟蹤系統不完善。因此，我們迫切需要建立Lynch綜合征相關子宮內膜癌注冊隨訪制度，有利于了解其在我國的發生率，分析其表型和MMR基因的突變特點，探討適合我國國情的分子遺傳學診斷方法和預防性治療，從而進一步提高我國Lynch綜合征相關子宮內膜癌的篩選方法和診治水平。

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Screening for lynch syndrome in endometrial carcinoma

YANG Tong-yin, YI Wei, CHU Ming-liang, ZHANG Zhu-xue, LIN Yong-shun

(DepartmentofPathology,GuizhouProvincialPeople’sHospital,Guiyang550002,China)

Purpose To evaluate the application of mismatch repair (MMR) genes proteins expression and methylation-specific to screen for Lynch syndrome patients. Methods 126 endometrial carcinoma patients were tested the protein expression of hMSH2, hMSH6h, hMLH1, hPMS2 by immunohistochemically of SP, and the methylation status of hMLH1 genes by the methylation-specific PCR. Results The result of MMR immunocytochemistry showed that 22% (28/126) cases lacked MMR protein expression, including hMLH1-/hPMS2-in 12 cases, 4 hMSH2-/hMSH6-, 6 hPMS2-, 3 hMLH6-and 3 hMLH1-. Meanwhile, the methylation-specific PCR test showed that 9 cases was methylation status of hMLH1 genes in 15 cases hMLH1-, and suggested the patients might be sporadic endometrial carcinoma. Conclusion Immunohistochemical of SP staining for MMR proteins in endometrial carcinoma patients, accompanied by testing for the methylation status of hMLH1 genes, may be an effective approach to screen for Lynch syndrome.

endometrial neoplasm； Lynch syndrome； mismatch repair genes； immunohistochemically

時間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.009.html

貴州省人民醫院青年基金[GZSYQN(2016)18號]

貴州省人民醫院病理科，貴陽 550002

楊通印，男，碩士，主治醫師。E-mail: yw9873@sina.com 易 韋，女，主任醫師，通訊作者。E-mail: yiwei6252@sina.com

R 735.33

A

1001-7399(2017)03-0273-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.009

接受日期：2017-01-01