miR-31通過結合Dock180抑制乳腺癌細胞侵襲

鄭書賢，孫雪梅，王瑞鴿，史立宏，張寶剛

miR-31通過結合Dock180抑制乳腺癌細胞侵襲

鄭書賢1，孫雪梅1，王瑞鴿1，史立宏2，張寶剛1

目的 探討miR-31表達與Dock180表達的相關性，以及miR-31通過結合Dock180對乳腺癌細胞侵襲能力的影響。方法 通過脂質體轉染技術，將miR-31轉染乳腺癌細胞系過表達miR-31；采用熒光酶報告基因檢測miR-31與Dock180的結合方式；應用Western blot法檢測miR-31表達不同的乳腺癌細胞中Dock180和其他相關蛋白的表達；RT-PCR檢測miR-31與Dock180 mRNA的關系；基質膠侵襲實驗檢測miR-31過表達時，乳腺癌細胞的侵襲能力。結果 在乳腺癌細胞中，miR-31靶向結合Dock180，且Dock180蛋白表達與miR-31表達呈負相關，Dock180下調和miR-31上調削弱了乳腺癌的侵襲能力。結論 miR-31可通過結合Dock180抑制乳腺癌細胞的侵襲。

乳腺腫瘤；miR-31；Dock180；侵襲

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發病率與病死率逐年上升，侵襲和轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因[1]。Dock180是作為信號銜接蛋白(Crk)下游因子為人們熟知，相對分子質量約1.80×105。Dock180作為小GTP酶Rho家族的鳥嘌呤核苷交換因子(guanine-nucleotide exchange factor, GEF)，是調節肌動蛋白細胞骨架及細胞形態的重要分子[2]。Li等[3]的研究表明，Dock180參與乳腺癌的侵襲。作者推測有microRNA(miRNA)參與調節Dock180的表達，通過Target Scan靶點預測工具(http://www.targetscan.org/)搜索，發現Dock180基因為miR-31潛在的靶基因。近來，大量研究表明[4-8]，miR-31可以抑制乳腺癌的侵襲[5]和轉移[6]，促進凋亡[7]。因此，miR-31在乳腺癌中異常低表達，有望成為乳腺癌篩查、診斷乃至治療中的新靶點。因此，為進一步明確miR-31和Dock180的關系，需對兩者進行深入分析。本文旨在探討miR-31是否參與調節Dock180的表達，且miR-31和Dock180結合對乳腺癌侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人類乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7購自American Type Culture Collection(ATCC)公司；培養基及相關試劑購自Hyclone公司；細胞裂解液、胰酶等購自北京碧云天公司；兔抗人Dock180單抗購自北京中杉金橋公司；侵襲實驗所用的Transwell小室購自Corning公司；Matrigel購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7細胞置于37 ℃ 5%CO2的濕潤環境中常規培養。MDA-MB-231(2×105個)細胞種植于4個35 mm培養皿內，24 h后根據試劑盒說明書將miR-31陰性對照、miR-31、miR-31抑制劑、miR-31抑制劑陰性對照的Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA))轉染MDA-MB-231。轉染后分別命名為MDA-MB-231/NC、MDA-MB-231/miR-31、miR-31 inhibitor、inhibitor NC，于37 ℃、5%CO2環境下培養，以供后續實驗使用。

1.2.2 體外癌細胞侵襲實驗 按照文獻[5]方法進Transwell小室侵襲實驗。將轉染成功的MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC分別用胰蛋白酶消化，1×105個細胞種于Transwell小室的上室，預涂層為20 μg Matrigel(基質膠)，下室為10%胎牛血清作為化學引誘物。37℃、5%CO2溫箱孵育24 h后取出培養板，棄去Transwell小室內培養基，用棉簽擦掉上室的基質膠和非侵襲細胞，下室用甲醇固定10 min后，常規HE染色，400倍光鏡下觀察5個高倍鏡視野，計數Transwell小室下室的細胞數即為穿透人工基膜的細胞數，每個實驗重復3次，取平均數作為實驗結果。

1.2.3 Western blot法 使用Western blot法檢測轉染后細胞的Dock180蛋白表達量，β-actin作為內參。轉染后的MDA-MB-231/NC、MDA-MB-231/mR-31、miR-31 inhibitor、inhibitor NC細胞常規培養72 h提取總蛋白，蛋白變性后經SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗孵育過夜、二抗孵育后顯影得到Dock180的蛋白表達情況。實驗重復3次，結果用Image J軟件處理，以第一個數值作為基數，其他數值與第一個數值的比值為相對密度。

1.2.4 RT-PCR法 用Trizol抽提細胞總RNA，5 ng總RNA為模板，在引物的指引下以dNTP為原料經過變性、復性、延伸35個循環合成cDNA，Dock180的表達水平應用Quantity One 4.62定量分析。

1.2.5 熒光素酶報告實驗 MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC細胞各3.5×104個接種于48孔板。設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段Dock180-3′UTR，將此片段插入到熒光素酶報告基因腺病毒中構成pGL-Dock180-3′UTR。培養24 h后，Lipofectamine 2000轉染。轉染48 h后用熒光素酶報告實驗工具箱依據公司給與的說明檢測pGL-Dock180-3′UTR的相對熒光酶素活性。

1.3 統計學方法 所有數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，統計方法采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-31與Dock180的3′UTR互補結合 通過Target Scan靶點預測工具搜索，結果顯示miR-31與Dock180的3′UTR互補結合(圖1)。

2.2 miR-31在3種乳腺癌細胞系中的表達 本實驗選擇3種乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435(侵襲力依次增強)，RT-PCR檢測顯示，miR-31在3種乳腺癌中表達不同，侵襲力較弱的MCF-7高表達miR-31，侵襲力強的MDA-MB-435低表達miR-31，MDA-MB-231表達居中。提示miR-31的表達量與乳腺癌細胞系的侵襲能力呈反比(圖2)。

圖1 miR-31與Dock180的3′UTR互補結合

圖2 miR-31在3種乳腺癌細胞系中的表達

2.3 Dock180的表達與miR-31呈負相關 miR-31可以結合Dock180，但miR-31對Dock180表達量的影響未知。采用Western blot法檢測轉染后細胞中Dock180的表達, MDA-MB-231/miR-31中Dock180低表達，miR-31 inhibitor中Dock180高表達；Dock180的表達與miR-31呈負相關(圖3)。

圖3 Dock180的表達與miR-31呈負相關

2.4 miR-31與Dock180的3′UTR結合抑制其翻譯 miRNA通過兩種方式對靶基因的表達進行反向調節，一種是與mRNA結合，使其降解；另一種是結合在mRNA的3′UTR，抑制翻譯。為了證明miR-31與Dock180作用方式，本實驗通過RT-PCR分別檢測MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC中Dock180 mRNA的表達。MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC中，Dock180 mRNA表達量的差異無統計學意義(P>0.05)。提示miR-31不是結合在Dock180 mRNA上使其降解，而是結合在Dock180的3′UTR上抑制翻譯(圖4)。

2.5 miR-31通過與Dock180的3′UTR靶向結合降低Dock180的翻譯 本組采用熒光素酶報告基因實驗檢測MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC的pGL-Dock180-3′UTR的相關熒光素酶活性，MDA-MB-231/NC的活性明顯高于MDA-MB-231/miR-31，差異有統計學意義(P<0.05)，提示miR-31結合Dock180的3′UTR(圖5)。

圖4 RT-PCR檢測MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC中 Dock180 mRNA表達差異

圖5 MDA-MB-231/NC、MDA-MB-231/miR-31的 pGL-Dock180-3′UTR的相關熒光素酶活性

2.6 miR-31對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲性的影響 采用基質膠侵襲實驗檢測MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC的侵襲能力。與MDA-MB-231/NC相比，MDA-MB-231/miR-31穿過人工基膜的細胞減少，差異有統計學意義(P<0.05，圖6)。

圖6 MDA-MB-231/miR-31、MDA-MB-231/NC的侵襲能力比較

3 討論

乳腺癌在演進過程中以侵襲力強、轉移早、化療多重耐藥為特點[9]。其中，乳腺癌細胞的擴散是患者病情急劇惡化的重要原因，其中對細胞外基質和基膜的侵襲是乳腺癌侵襲轉移過程中的關鍵環節[10]。進一步探討乳腺癌演進的機制，抑制乳腺癌侵襲和轉移是提高患者生存質量，延緩患者病情甚至治愈乳腺癌的關鍵。

miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，Iorio等[11]表明miRNA參與乳腺癌的發生，且miRNA的表達與ER狀態相關，參與腫瘤的侵襲轉移。miRNA在不同部位腫瘤組織中的表達出現上調和下調兩個方向變化。一方面，miR-31在乳腺癌[4-8]、胃癌[12]及卵巢癌[13]中的表達水平均明顯降低，可抑制DNA復制及細胞周期或侵襲。本組實驗發現與MDA-MB-231/NC相比，MDA-MB-231/miR-31中miR-31過表達削弱乳腺癌細胞系的侵襲能力，提示本實驗結果與上述報道相符。然而，在有些癌癥中miR-31的過表達反而會增強腫瘤細胞的侵襲能力，在Cottonham等[14]報道中，miR-31過表達可增強直腸癌細胞系的遷移和侵襲能力。Xu等[15]發現，結腸癌中miR-31可能通過靶基因RhoBTB1促進結腸癌的發生。

本實驗發現miR-31可以與Dock180的3′UTR特異性的靶向結合，每個miRNA可以結合多個靶基因[6,8]，而幾個miRNA也可以調節同一個基因[14]。這種復雜的調節網絡既可以由一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNA的組合來共同調控某個基因的表達。miRNA通過兩種方式對靶基因的表達進行反向調節，一種方式為依賴miRNA誘導的基因沉默，miRNA與編碼蛋白質的mRNA近乎完全互補，其沉默復合體被相關酶切斷致使靶基因降解；另一種方式通過與靶基因mRNA的部分堿基互補(通常發生在 3′非翻譯端)，降低蛋白質翻譯水平。為了證明miR-31通過哪種方式結合Dock180，本實驗采用熒光酶報告基因分析證明miR-31特異性作用于Dock180的3′UTR。通過Western blot法檢測MDA-MB-231/miR-31組的Dock180蛋白表達與MDA-MB-231/NC相比下降，miR-31 inhibitor的Dock180的表達上調，進一步證實Dock180是miR-31的靶基因。Li等[3]的實驗證明，在乳腺癌中趨化因子CXCL12與其受體CXCR4結合促進Dock180與ELMO穩定結合形成復合體，進而激活Rac促進肌動蛋白的聚合反應；為miR-31通過結合Dock180抑制乳腺癌的侵襲提供了理論依據。

綜上所述，miR-31可通過結合Dock180抑制乳腺癌侵襲，有望成為通過Dock180逆轉乳腺癌侵襲的新靶點，提高患者的生存質量。但是，miR-31通過結合Dock180抑制乳腺癌的具體機制尚不清楚，有待進一步探討。

(本文獲得國家留學生基金管理委員會資助，特此鳴謝！)

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MiR-31 inhibit the invasion of breast cancer by Dock180

ZHENG Shu-xian1, SUN Xue-mei1, WANG Rui-ge1, SHI Li-hong2, ZHANG Bao-gang1

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofPharmacology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China)

Purpose To investigate the correlation of Dock180 and miR-31 expression in breast cancer cells, and to observe the effect of miR-31 on the invasion of breast cancer cells by Dock180. Methods MiR-31 was transfected into breast cancer cells by liposome transfection technique. The actual binding site of miR-31 to the 3′-untranslated region of Dock180 was confirmed through luciferase assay. Western blot was performed to detect the expression of Dock180 and other related proteins. Real-time PCR was used to measure the expression of Dock180. Matrigel invasion were performed to detect the invasion of breast cancer cell lines with miR-31 increased. Results The protein levels of Dock180 in breast cancer cell lines negatively correlated with miR-31 expression, and Dock180 was directly targeted by miR-31. Dock180 downregulation and miR-31 overexpression reduced breast cancer cells invasion. Conclusion Dock180 modulated by miR-31 plays an important function in breast cancer cell lines invasion.

breast neoplasm； miR-31； Dock180； invasion

時間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.002.html

國家自然科學基金(81072068、81672631)、山東省自然科學基金中青年科學家獎勵基金(2010BSB14051)、山東省教育廳課題(J14LK13)

濰坊醫學院1病理學教研室、2藥理學教研室，濰坊 261053

鄭書賢，女，碩士研究生。Tel:(0536)8462034，E-mail: shuxianzheng@126.com 張寶剛，男，教授，通訊作者。E-mail: zbg0903@hotmail.com

R 737.9

A

1001-7399(2017)03-0241-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.002

接受日期：2017-01-23