CTLA-4(AT)n多態性與過敏性紫癜的相關性研究

侯紅紅，賀改濤，劉 麗，黃燕萍

(1.西安市中心醫院，陜西 西安 710003；2.西安交通大學第一附屬醫院，陜西 西安 710061)

CTLA-4(AT)n多態性與過敏性紫癜的相關性研究

侯紅紅1，賀改濤2，劉 麗2，黃燕萍2

(1.西安市中心醫院，陜西 西安 710003；2.西安交通大學第一附屬醫院，陜西 西安 710061)

目的 探討細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(CTLA-4)(AT)n多態性與兒童過敏性紫癜的相關性。方法 選取2014年1月至2015年12月在西安交通大學第一附屬醫院住院診斷為過敏性紫癜的患兒60例為病例組，另選取健康普查的30例健康兒童作為對照組。采用ABI3130xl測序儀進行毛細管電泳對第4外顯子3′端的AT重復序列進行基因分型。分析微衛星的等位基因頻率在各組間的分布。結果 ①微衛星(AT)n在病例組和對照組共檢出等位基因19種，AT重復次數5～34不等，當AT重復次數為16時，等位基因頻率在病例組與對照組間差異有統計學意義(P=0.034，OR=2.115，95%CI：1.049～4.267)；②微衛星(AT)n按有無腎臟損害分層：各等位基因頻率在有腎臟損害的過敏性紫癜(HSPN)組與無腎臟損害的過敏性紫癜(NHSPN)組差異均無統計學意義(均P>0.05)；③微衛星(AT)n按性別分層：當AT重復次數為15時，等位基因頻率在男女兩組間差異有統計學意義(P=0.014，OR=0.210，95%CI：0.055～0.805)。結論 CTLA-4(AT)n基因多態性與過敏性紫癜(HSP)發病相關，AT基因重復次數為16時可能為HSP發病的易感基因，重復次數為15時可能為女性HSP患兒發病的易感基因。

細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4；基因多態性；過敏性紫癜；兒童

過敏性紫癜又稱亨-舒綜合征(Henoch-Schonlein Purpura，HSP)，是兒童時期常見的系統性血管炎性疾病，其基本病變為廣泛性無菌性小血管炎，以毛細血管壁炎性反應為主，毛細血管脆性和通透性增加，血漿及血細胞滲出，引起皮膚、黏膜以及內臟器官等多部位水腫、出血。該病病理改變為血管壁腫脹和壞死，血小板血栓形成，較重者可見壞死性小動脈炎。HSP的臨床特征為皮膚紫癜、消化道癥狀、關節炎及腎臟損害，少數可累及到神經系統和肺部，累及腎臟而出現蛋白尿和(或)血尿，稱為紫癜性腎炎(henoch-schonlein purpura nephritis，HSPN)。該病好發于學齡期兒童，常見發病年齡為3～10歲，一年四季均有發病，冬春季節發病較多，夏季較少。

自HSP被描述以來已有兩個世紀之久，學者們對其發病機制進行了不斷探索，但目前仍未完全清楚，普遍認為免疫紊亂是其發病的關鍵，包括體液免疫、細胞免疫及免疫分子的參與。患者體內CD4+/CD8+及Th1/Th2比值發生異常，導致T細胞功能紊亂，多種免疫分子分泌異常，B細胞多克隆活化，促使免疫球蛋白分泌增多，尤其是IgA，IgA免疫復合物沉積于皮膚、內臟血管內皮及腎臟組織，引起血管損傷出血及腎臟損害，出現相應臨床癥狀[1]。流行病學研究提示，HSP具有遺傳易感性，該病發病具有有一定家族聚集性，家族中常見聚集傾向，同胞中可見先后發病者[2]。隨著基因水平研究技術的提高和深入，學者們對于HSP與基因的研究也越來越多。

細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte associated ant igen-4，CTLA-4)又名CD152，是免疫球蛋白超家族成員，在激活的T淋巴細胞表面表達，其不僅對T細胞活化起負向調節作用，還可調節T細胞分化[3]，維持機體T細胞相關的免疫平衡，故可推測CTLA-4功能異常會導致自身免疫性疾病的發生，包括HSP。

人類CTLA-4基因位于2q33，包含4個外顯子和3個內含子，緊接外顯子4的是一段UTR，其中包括一段(AT)n重復序列，AT重復次數較多者，其個體T細胞反應性會隨之增強，mRNA的穩定性降低，降解速度增快，CTLA-4蛋白表達水平下降，導致這些個體發生自身免疫性疾病的易感性增加；相反，AT重復次數較少者，其個體可以表達高水平CTLA-4，保護機體免于發生自身免疫性系病,由此可見，CTLA-4基因多態性可決定CTLA-4的表達水平和調節功能。本研究將對(AT)n多態性與HSP的相關性進行探討。

1材料與方法

1.1研究對象

選取2014年1月至2015年12月在西安交通大學第一附屬醫院住院的HSP患兒60例為病例組，HSP的診斷符合諸福棠《實用兒科學》[4]中的標準，均為陜西省漢族兒童，均為初發病例，入院前1個月未接受過糖皮質激素及免疫抑制劑等治療，排除了其他疾病如血液系統疾病、結締組織病、原發腎病、乙肝病毒相關性腎炎及狼瘡性腎炎等繼發性腎臟損害，監護人知情同意。病例組中男性33例，女性27例，平均年齡7.57±2.73歲。按有無腎臟損害分為有腎臟損害的過敏性紫癜(HSPN組)和無腎臟損害的過敏性紫癜(NHSPN組)；HSPN組30例，平均年齡7.77±2.36歲，NHSPN組30例，平均年齡7.37±3.08歲。

對照組來源于西安交通大學第一附屬醫院門診健康普查的陜西省漢族兒童，病史詢問排除既往過敏性紫癜、系統性紅斑狼瘡等疾病，4周內無感染及過敏史，經體格檢查、肝腎功、尿常規等實驗室檢查后確定為健康兒童，共30例，其中男性18例，女性12例，平均年齡7.57±2.54歲。

1.2研究方法

1.2.1血標本的采集及DNA的提取

研究對象暫禁食12小時，次日清晨抽取空腹靜脈血2mL，置于含有EDTA抗凝液的試管中，于-80℃冰箱低溫保存。由北京天根生物公司合成的人類基因組全血DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2(AT)n基因多態性分析

①取1μL(AT)n PCR產物，加入24μL滅菌超純水振蕩混勻，將PCR產物稀釋25倍；②將9μL LIZ500稀釋液(0.2μL LIZ500+8.8μL Hi-Di)分裝到PCR孔板，然后加入1μL上述25倍稀釋的PCR產物，振蕩混勻后95°C變性5分鐘；③采用ABI3130xl測序儀進行毛細管電泳，所產生的數據文件用Gene Mapper 4.0分析以判斷基因型。

1.3統計學方法

統計出CTLA-4基因(AT)n等位基因頻率，采用SPSS 18.0統計軟件，應用卡方檢驗比較以上等位基因頻率在各組間分布是否存在差異，以此判斷某等位基因與疾病的相關性，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1基因分型膠電泳圖

將(AT)n PCR產物適當處理后，采用ABI3130xl測序儀進行毛細管電泳，得到每個樣本的分型膠電泳圖，單峰的為純合子，雙峰的為雜合子，見圖1、圖2。

圖1 純合子分型膠電泳圖

Fig.1 Homozygous type gel electropherogram

圖2 雜合子分型膠電泳圖

Fig.2 Heterozygous type gel electropherogram

2.2研究對象的遺傳吻合度檢驗

因微衛星變異較大，本研究納入病例組60例，對照組30例，所測出的基因型在病例組為30種，在對照組為17種，分別求得病例組與對照組各基因型的實際頻數與期望頻數后，經比較人群(AT)n位點基因型實際頻數與期望頻數之間差異均無統計學意義(均P>0.05)，樣本具有群體代表性，可用于群體遺傳學研究，見表1。

表1 遺傳平衡吻合度檢驗

Table 1 Inspection of genetic equilibrium alignment

STR 病例組 對照組 χ2Pχ2P(AT)n8．5801．0005．7230．991

2.3基因多態性分布情況

本研究CTLA-4(AT)n重復序列依AT重復次數不同可觀察到19種等位基因，AT重復次數從5次到34次不等。

2.3.1病例組與對照組各等位基因頻率的比較

當AT重復次數為16時，等位基因頻率在病例組與對照組間差異有統計學意義(P<0.05)，此等位基因為HSP發病的危險因素，見表2。

表2 (AT)n等位基因頻率在病例組與對照組間的比較結果[n(%)]

注：a表示采用Fisher確切概率檢驗。

2.3.2病例組中有無腎臟損害分層多態性分析

各等位基因頻率在HSPN組與NHSPN組比較差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表3。

表3 (AT)n等位基因頻率在HSPN組和NHSPN組的比較結果[n(%)]

注：a表示采用Fisher確切概率檢驗。

2.3.3病例組中性別分層多態性分析

當AT重復次數為15時，等位基因頻率在男女組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，此等位基因為女性HSP發病的危險因素，見表4。

表4 (AT)n等位基因頻率在男女兩組的比較結果[n(%)]

注：a表示采用Fisher確切概率檢驗。

3討論

CTLA-4(AT)n序列是位于外顯子4末尾3′端的一串AT重復序列，屬于STRs，若AT在HSP中以異常高的頻率出現，則表明它與HSP發病具有相關性。(AT)n與重癥肌無力[5-6]、潰瘍性結腸炎及克羅恩病[7-8]的研究均提示它與這些自身免疫性疾病存在相關性，某些異常增高的AT重復次數為這些疾病發病的危險因素。對于此微衛星位點與HSP的相關性，國內外未見報道，本研究為首次對二者進行相關性分析。

3.1(AT)n等位基因頻率在病例組和對照組的差異分析

本研究檢測到AT重復次數從5次到34次不等，每一個重復次數便代表一種等位基因，共檢出19種。通過比較發現，當AT重復次數為16時，等位基因頻率在病例組與對照組間差異有統計學意義(P<0.05)，此等位基因為HSP發病的危險因素；可能系此重復序列影響CTLA-4的分子表達，使其對T細胞的抑制作用減弱，T細胞大量增殖活化，導致免疫分子分泌異常，增加了疾病的發病風險。

3.2(AT)n等位基因頻率在有無腎臟損害的差異分析

將HSP組按照有無腎臟損害分層后比較，發現各等位基因頻率在HSPN組與NHSPN組間差異均無統計學意義(均P>0.05)，證明各等位基因不能增加HSP患兒發生腎臟損害的風險。

3.3(AT)n等位基因頻率在男女間的差異分析

將HSP按性別分層后分析發現，當AT重復次數為15時，等位基因頻率在男女兩組間差異有統計學意義(P<0.05)，女性組等位基因頻率高于男性，說明此等位基因頻率可能是女性HSP患兒發病的危險因素；分析原因，可能系存在這些易感基因的患兒體內CTLA-4表達水平下降，T細胞增殖及分化異常，造成免疫紊亂，增加了疾病的發生幾率。

綜上所述，CTLA-4作為維持機體免疫穩態的一個重要分子，其基因多態性與HSP有著密切的聯系，雖然其具體機制尚不能明確，但CTLA-4基因多態性對HSP的易感性、預后判斷和治療有著重要的意義。本次研究的樣本量較少，故還需加大樣本量去進一步研究證實；也可以進一步研究CTLA-4其他位點基因多態性與HSP的相關性，從基因水平對其發病機制進行探討。

[1]López M R, Genre F, Pérez B S,etal.Association of HLA-B*41:02 with Henoch-Sch?nlein purpura (IgA Vasculitis) in Spanish individuals irrespective of the HLA-DRB1 status[J].Arthritis Res Ther,2015,17:102.

[2]He X,Yu C,Zhao P,etal.The genetics of Henoch-Sch?nlein purpura:a systematic review and meta-analysis[J].Rheumatol Int,2013,33(6):1387-1395.

[3]Ahmadi S, Rostamzadeh J, Khosravi D,etal.Association of CTLA-4 gene 49A/G polymorphism with the incidence of type 1 diabetes mellitus in the Iranian Kurdish population[J].Pak J Biol Sci,2013,16(24):1929-1935.

[4]胡亞美,江載芳,申昆玲,等.諸福棠實用兒科學[M].8版.北京:人民衛生出版社,2015:773-775.

[5]毛海婷,王雄彪,張玲,等.CTLA-4基因多態性在重癥肌無力發病機理中的作用[J].中華醫學遺傳學雜志,2004,21(6):574-578.

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[7]Zhang M, Ni J, Xu W D,etal.Association of CTLA-4 variants with susceptibility to inflammatory bowel disease:a meta-analysis[J].Hum Immunol,2014,75(3):227-233.

[8]Lee Y H,Kim J H,Seo Y H,etal.CTLA-4 polymorphisms and susceptibility to inflammatory bowel disease:a meta-analysis[J].Hum Immunol,2014,75(5):414-421.

[專業責任編輯：吳紅艷]

Association between CTLA-4 (AT)n gene polymorphism and Henoch-schonlein purpura

HOU Hong-hong1, HE Gai-tao2, LIU Li2, HUANG Yan-ping2

(1.Xi’anCentralHospital,ShaanxiXi’an710003,China;2.FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To investigate the association between cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4 (CTLA-4) (AT)n gene polymorphism and Henoch-schonlein purpura (HSP) in children. Methods Sixty children diagnosed as HSP in the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University from January 2014 to October 2015 were enrolled in case group. Thirty healthy children receiving health examination were enrolled in control group. Genotyping of 3’untranslated region of exon 4 was performed using capillary electrophoresis with ABI3130xl. Distribution of allele frequencies of microsatellite in different groups was analyzed. Results Totally 19 allele of microsatellite (AT)n were detected in both groups, among which AT repeated from 5 to 34 times. Significant difference was indicated in the comparison of allele frequencies between two groups when the repetition of AT was 16 (P=0.034,OR=2.115, 95%CI: 1.049-4.267). Microsatellite (AT)n was delaminated according to whether there was kidney damage, and there was no statistical significance in allele frequency between HSPN and NHSPN (P>0.05). Microsatellite (AT)n was delaminated according to gender, and there was statistical significance in allele frequency between male and female when AT repeated for 15 times (P=0.014,OR=0.210, 95%CI:0.055-0.805). Conclusion CTLA-4 (AT)n is associated with the susceptibility of HSP. Allele in which AT repeats 16 times may be the susceptible factor of HSP; and allele in which AT repeats 15 times may be the susceptible factor of HSP for female patients.

cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4 (CTLA-4); polymorphism; Henoch-schonlein purpura (HSP); children.

2016-10-19

侯紅紅(1989-)，女，住院醫師，碩士，主要從事兒童腎病的研究。

黃燕萍，主任醫師/教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.04.008

R725

A

1673-5293(2017)04-0385-04