生川烏片炮制過程中5-HMF含量隨炮制時間的變化規律研究

王蕾，張語凡，王鑫，彭詩濤，袁金鳳，張先靈，陳炯，李飛*

(1.北京中醫藥大學，北京 100102；2.河北省中醫院，河北 石家莊 050011)

生川烏片炮制過程中5-HMF含量隨炮制時間的變化規律研究

王蕾1，張語凡1，王鑫1，彭詩濤1，袁金鳳1，張先靈1，陳炯2，李飛1*

(1.北京中醫藥大學，北京 100102；2.河北省中醫院，河北 石家莊 050011)

目的：考察生川烏片炮制過程中5-羥甲基糠醛(5-HMF)含量隨炮制時間的變化規律。方法：按照2015版《中華人民共和國藥典》(一部)制川烏項下的蒸與煮法，分別制備不同炮制時間的制川烏片，采用HPLC法測定川烏各炮制品中5-HMF的含量。結果：生川烏片中5-HMF含量為4.45 μg/g；煮制品及蒸制品在6 h之內，5-HMF的含量變化規律基本一致，均隨加熱時間延長呈非線性增加。在相同的時間點，蒸制品含量顯著高于煮制品。 結論：首次建立了HPLC法測定川烏中5-HMF含量的方法，該法穩定、可靠；生川烏片在蒸、煮兩種加熱方式下5-HMF含量的變化規律與加熱時間有關，該結果對川烏飲片中5-HMF的檢測及其質量控制提供參考。

生川烏片；炮制；HPLC；5-羥甲基糠醛

川烏為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx．)的干燥母根，味辛、苦，性熱，有大毒，歸心、肝、脾經，具有祛風除濕、溫經止痛功效[1]。川烏中主要含有生物堿類及多糖類成分。在炮制過程中，川烏中的多糖可能發生糖苷鍵的水解和糖的脫水反應，生成5-羥甲基糠醛(5-HMF)。目前，尚未見炮制對川烏中5-HMF影響的相關研究報道。因此，作者建立了川烏中5-HMF的含量測定方法，并對生川烏片及不同煮制時間和蒸制時間的制川烏片中5-HMF的含量進行檢測，分析其含量隨煮制和蒸制時間的變化規律，為川烏飲片的質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀(DAD檢測器、自動進樣器、在線脫氣機、四元泵，Agilent公司)；Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)； BS210S型電子天平(德國Sartorius公司，Max 210 g，d=0.1 mg)；超聲波清洗器(SB22-12DTDN型，寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

川烏片(購于四川江油中壩附子科技發展有限公司，經中國食品藥品檢定研究院張繼主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)的母根)；5-羥甲基糠醛(批號MUST-15051212，成都賽思特生物科技有限公司，純度>98%)；甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 炮制品的制備

生川烏片:取生川烏片，凈制，備用。

煮制川烏片：參照2015版《中國藥典》制川烏項下煮法炮制。取生川烏片，用水浸泡約5 h達內無干心，取出，加寬水分別沸水煮40 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，取出，干燥。

蒸制川烏片：參照2015版《中國藥典》制川烏項下蒸法炮制。取生川烏片，用水浸泡約5 h達內無干心，取出加水分別蒸1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，取出，干燥。

觀察上述炮制品的外觀性狀，均達到內無白心的質量要求，但麻舌感程度不同，結果見表2。以上樣品分別粉碎，過3號篩，備用。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品適量于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，即得含5-羥甲基糠醛662 μg/mL的對照品母液。精密吸取一定量母液，加甲醇定容配制成濃度為0.066 2，0.662，1.986，3.31，4.634，5.985，7.282 μg/mL的系列對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

分別精密稱取各炮制品粉末約1 g，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入體積分數80%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲提取20 min，放冷，再稱定重量，用體積分數80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液適量，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

2.4 色譜條件

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；甲醇為流動相A，以0.1%甲酸溶液為流動相B。洗脫梯度：0～5 min，5%A；5～20 min，5%～20%A；20～21 min，20%～80%A；21～35 min，20%A。檢測波長284 nm；柱溫25℃，流速1.0 mL/min；進樣量10 μL。

2.5 標準曲線的繪制

精密吸取5-HMF的系列濃度對照品溶液各10 μL，進樣測定，以峰面積y對濃度x進行線性回歸。線性回歸方程為：y=74.906x+15.667(R2=0.999 6，n=7)，5-羥甲基糠醛在0.066 2～7.282 μg/mL范圍內線性關系良好。標準曲線見圖1。

圖1 5-羥甲基糠醛標準曲線

2.6 精密度試驗

精密吸取濃度為2.648 μg/mL的 5-HMF對照品溶液，連續6次進樣10 μl，依法測定峰面積，測得5-HMF峰面積的RSD為0.74%(n=6)，表明該方法精密度良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取已知含量為48.78 μg/g的制川烏粉末1 g，平行共6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，依法測定，測得5-HMF峰面積的RSD為1.90%(n=6)。結果表明，該方法的重復性良好。

2.8 穩定性試驗

取已知含量為48.78 μg/g的制川烏粉末1 g，按“2.3”項下制備供試品溶液，在制備后0，2，4，8，12 h分別進樣10 μL，測定峰面積，計算得到5-HMF的RSD為1.58%。結果表明，供試品溶液在12 h 內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

稱取已知含量為48.78 μg/g的制川烏粉末0.5 g，精密稱定，平行共6份， 加入一定量的5-HMF對照品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進行測定，計算5-羥甲基糠醛的平均回收率為98.58%，RSD為1.90%(n=6)，結果見表1。

表1 5-HMF加樣回收率試驗結果(n=6)

2.10 樣品的含量測定

將川烏的各炮制品按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，每批次樣品平行操作2份，按“2.4”項下色譜條件依法測定，計算生川烏片及不同炮制時間的制川烏片中5-HMF含量。結果見表2，色譜圖見圖2，5-HMF含量隨煮制時間變化見圖3。

表2 川烏各樣品中5-HMF的含量(n=2)

圖2 5-HMF對照品、生川烏片、不同煮制、蒸制時間的制川烏片HPLC圖

圖3 5-HMF含量隨炮制時間的變化規律

3 討論

傳統直接以生川烏為原料浸泡達到同等程度約36 h[2]，本文采用生川烏片制備制川烏，其中浸泡至“內無干心”的時間約5 h；川烏產地切片雖使其成分有流失，但在制備制川烏過程中可大幅度縮短浸泡時間，節約工時，并在一定程度上減少成分流失。

本文建立了川烏中5-HMF的HPLC含量測定方法，該方法操作簡單，結果穩定可靠，可作為制川烏飲片的質量控制的檢測方法。

5-HMF是炮制過程中糖類美拉德反應產生的中間產物。結果表明，生川烏片炮制前后5-HMF的含量變化明顯，且含量高低與炮制時間和加熱方式有關。在6 h內，蒸或煮川烏片中的5-HMF的含量變化規律基本一致，均隨著炮制時間的延長而呈非線性增加。加熱1 h時，蒸或煮制川烏片中含量約為生品的5～6.3倍；加熱在2～4 h之間，含量波動很小，煮制品的含量約為生品的10.9～11.7倍，蒸制品的含量約為生品的15.6～17.5倍；5～6 h，煮制品5-HMF含量急劇增加，約為生品的12.1～20.1倍；蒸制品含量則在4～5 h急劇增加，約為生品的34.4～41.3倍。同時，蒸制及煮制川烏片的顏色亦隨著炮制時間的延長而加深，麻舌感逐漸減弱或消失。當制川烏片的外觀顏色基本一致時，同一加熱方式下的炮制品中的5-HMF含量也基本一致。此外，蒸制6 h之后，5-HMF含量呈波動變化，但無麻舌感，飲片片型皺縮，飲片顏色呈黑褐色，傳統性狀不符合《中國藥典》要求。比較相同加熱時間下的蒸制川烏和煮制川烏，結果發現蒸制川烏片中5-HMF的含量均明顯高于煮制川烏片，可能與5-HMF易溶于水[3]，在煮制過程中大量流失在水煮液中有關。該研究結果可為制川烏片的炮制工藝及質量評價指標的選擇和質量標準的制定提供借鑒。

體內外藥理實驗結果顯示，5-HMF對CCl4急性肝損傷組織有保護作用；亦對由H2O2和葡萄糖所致血管內皮細胞損傷后的細胞均具有保護作用[4]。同時，5-HMF具有抗氧化、抗心肌缺血等對人體有益的作用[5-6]，但亦有研究表明5-HMF對人體橫紋肌和內臟有毒副作用[7]。因此，炮制過程中5-HMF的含量變化對制川烏的質量評價具有一定意義，但尚須進一步研究，結合其藥理、毒理作用及其對制川烏的外觀性狀、生物堿含量的影響等進行綜合評價，以保障制川烏的安全性、有效性。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫藥科技出版社，2015:39-40.

[2] 秦語欣,譚鵬,國偉,等.藥典法制川烏的成品質量與炮制過程控制的關系[J].中華中醫藥雜志,2015,30(7):2548-2550.

[3] 吳立軍.天然藥物化學[M].4版.北京:人民衛生出版社,2004:73-74.

[4] 丁霞,王明艷,余宗亮,等.山茱萸中5-羥甲基糠醛的分離鑒定及生物活性研究[J].中國中藥雜志,2008,33(4):392-396.

[5] 夏云,李志明,朱丹妮,等.化學生脈散復方化學動態變化與藥效關系的研究生脈散復方化學的研究(Vi )[J].中國中藥雜志,1998,23(4):230-231.

[6] 許臘英,余鵬,毛維倫,等.中藥烏梅的研究進展[J].湖北中醫學院學報,2003,5(1):52-57.

[7] Surh Y,Tannenbaum SR.Activation of the Maillard reaction product 5-Hydroxymethyl furfural to strong mutagens via allylic sulfonation and chlorination[J].Chem Res Toxicol,1994,7(3):313-318.

Changes of 5-hydroxymethylfurfuraldehyde Content in Radix Aconiti Tablets Processed at Different Time Points

WANG Lei1,ZHANG Yu-fan1,WANG Xin1,PENG Shi-tao1,YUAN Jin-feng1,

ZHANG Xian-ling1,CHEN Jiong2,LI Fei1*

(1.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China; 2. Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, China)

Objective: To find the changing regularity of 5-Hydroxymethylfurfuraldehyde (5-HMF) content in Radix Aconiti tablets processed at different time points.Methods: HPLC was used to determine the changes of 5-HMF content in different processed products of Radix Aconiti.Results: The content of 5-HMF of the raw product was 4.45 μg/g. The content of 5-HMF was increased within the first six hours of heating. At the same processing time, the content of steamed products was significantly higher than that of boiled products. Conclusion: An HPLC method for determining the content of 5-HMF has been established. The proposed method is stable and reliable. The changes of the content of 5-HMF of Radix Aconiti tablets are processed by steaming and boiling for two kinds, which were associated with the heating time. It provides a reference for the quality control of Radix Aconiti.

Radix Aconiti tablets; Processing; HPLC; 5-hydroxymethylfurfural

國家中醫藥行業科研專項資助項目(No.201107008)；科技部科技基礎性工作專項資助項目(No.2014FY111100-3)

王蕾(1992-)，女，北京中醫藥大學2014級在讀碩士研究生，主要研究方向：中藥炮制。

李飛*(1963-)，女，教授，碩士研究生導師，主要研究方向：中藥炮制工藝、原理及其質量標準的研究。

2016-10-25

R285.5

A

1002-2406(2017)03-0017-03

修回日期：2016-11-01