淺談背向彈性散射光譜測量中獲取光譜的不同實驗方法與優點

黃崇崇

（長江大學物理與光電工程學院 湖北荊州 434020）

摘要：在生物細胞檢測領域，光學手段正發揮愈來愈重要的作用，其中，基于彈性散射光的光學檢測方法可以在不引入外源介質的情況下，測量分析處于自然狀態下的活細胞的內部結構分布及變化。和光強度角度分布探測方法相比，基于彈性散射光的測量方法具有光學系統簡單，獲取信號精度高等優勢。其檢測原理在于細胞內部的多種亞細胞器不僅呈顆粒狀，而且具有與細胞質不同的折射率，因此能夠使入射光產生彈性散射；通過測量入射激光在不同角度上的強度分布或某個固定角度上的光譜，即可完成細胞形態的檢測。

關鍵詞：散射光；光譜；實驗；

一、光譜獲取及分析的基本原理

（一）微米顆粒的背向彈性散射光譜特性

在不考慮光吸收的情況下，微米球形顆粒的背向散射光譜呈現規則的周期起伏。對于折射率與周圍介質相近的顆粒，這種特征可以由Ray-leigh-Gans近似公式來理解：

其中：L為測量距離，k=2π/λ，V為顆粒體積，m為顆粒的相對折射率（接近于1），I0為入射光強度，θ為散射角，G（u）=3（sin u-ucos u）/u3，x=ka定義為尺度參數，a為顆粒半徑。當θ≈180°時，光譜的周期性主要來自于G（2x）。一般顆粒的周期性需要通過Mie散射數值計算結果進行解讀。這種特征性周期光譜結構使得利用彈性散射光譜獲得超衍射極限分辨的顆粒尺度信息成為可能。

然而，在實際的光譜獲取及分析中，θ實際上仍然存在一個小范圍Δθ的波動，而且平均散射角θ并不一定嚴格等于180°，它們會對光譜分析產生一定的影響。

對于較小的顆粒即亞微米量級的顆粒，這種影響可以忽略；但對于較大的顆粒即微米量級的顆粒，這種影響比較明顯。由式（1）可以推斷：函數G取決于x與sinθ2的乘積，當x較大時，因θ變化產生的影響會比較大；另外，這也可以從Mie散射數值計算來加以理解。

比較了兩種尺度不同的聚苯乙烯微球顆粒在水溶液中其微分散射系數隨角度變化的Mie散射計算結果（即散射強度隨角度的變化）。這里入射波長為600nm，而聚苯乙烯和水的折射率按照各自的色散關系取值。從圖中可以看到，在θ=180°附近，直徑d=0.5μm顆粒的光強度變化較為平緩，而d=5μm顆粒的光強度變化較為明顯。圖中縱軸取對數坐標。因為不同波長的光散射強度會不同，所以顆粒越大，在θ=180°附近處的光譜變化會越明顯。

（二）基于光纖探頭的光譜獲取及分析

基于光纖探頭的顆粒背向彈性散射光譜獲取會因是否將光纖探頭插入顆粒溶液中以及光纖探頭的具體設計而有所不同。其基本原理，測量系統由一根傳輸光纖和一根收集光纖構成。光纖探頭在顆粒溶液之外，距離溶液面測量高度為h1，為了避免收集到來自溶液面的鏡面反射光，兩根光纖都沿垂直方向旋轉了一個角度β（一般取～25°）。

只有在兩個光纖數值孔徑（NA）重疊區域內的顆粒才能夠被探測到。而顆粒的位置不同，其平均散射角（π-θ）（定義為兩個光纖中心的張角）以及散射角范圍Δθ（定義為每個光纖的張角）實際上也不同。但是，當：h2<>（ρ+η）， （2）（其中：h2代表溶液厚度，ρ和η分別代表光纖的直徑以及光纖的間距）時，可近似認為所有顆粒的θ和Δθ相同，分別為：

由于實際測量中收集到的光強度反比于（h1+h3）的平方（h3代表顆粒所處的深度），h1不能過大，否則會導致信噪比過低，因此難以達到式（2）的條件。此時，θ和Δθ的取值分布較為復雜，給光譜的計算分析帶來了難度。

二、實驗結果及分析討論

（一）實驗樣品

實驗采用標準尺寸聚苯乙烯微球顆粒懸浮制品（PSN1005，納微科技）稀釋而成的顆粒懸浮溶液。該制品標明的顆粒直徑的平均值為4.955μm，標準方差為0.156μm，初始質量濃度為1%。再將溶液稀釋50倍使質量濃度為0.02%，在此濃度下用Mie散射數值計算可得入射光波長為550nm時，散射系數為μs=0.97cm-1。在光譜測量時，將這個稀釋顆粒溶液攪拌均勻后，倒入底面直徑為35mm的細胞培養皿（CORNING 430165）中，當倒入1mL顆粒溶液時，溶液厚度h2=1mm。在實驗中厚度最大為h2=3mm，這時對應的光學厚度為τ=μsh2=0.291。在這種條件下，忽略顆粒多次散射對測量的影響，認為背向散射光等于各個顆粒的單次散射光的非相干疊加。

（二）光纖探頭測量實驗

在光纖探頭光譜測量實驗中，光纖探頭（FCR-7UV200-2-ME，Avantes）由6根照明傳輸光纖緊密環繞1根收集光纖構成，光纖直徑均為200μm，數值孔徑NA均為0.22。光源采用脈沖氙燈（AvaLight-XE，Avantes），它耦合到一根600μm光纖的最大功率為180μW。

光譜儀為單通道光纖光譜儀 （AvaSpec-2048，Avantes），其測量光譜為300～900nm。本文分別取顆粒懸浮溶液厚度h2=1，2mm以及測量高度h1=3，6，9mm，共進行了6次實驗，得到了在3種測量高度下漫反射白色參考瓦（WS-2，Avantes）的光譜，將其記為參考光譜信號Sref；還探測了相同h2條件下去離子水的光譜信號作為背景信號（記為Sbg）。最后，獲得的顆粒背向散射信號為：

（三）透鏡系統測量實驗

基于透鏡的光譜測量系統如，實驗選用的光源為強度可調的連續氙燈 （TunablePowerArcTM1000，OBB Corporation），兩根光纖的直徑均為ρ=400μm、數值孔徑NA=0.22，實驗測得從傳輸光纖出射的光功率為230μW。兩個透鏡的直徑均為25.4mm、焦距f=35.0mm（AC254-035-A-ML，Thorlabs Inc.），立方體分束器為非偏振型，工作在可見光波段 （CMI-BS013，Thorlabs Inc.）。設收集光纖偏離位移Δx=800μm。同樣進行了6次實驗，所測的顆粒懸浮溶液厚度h2分別為2，3mm，測量高度距離h1分別為9，12，15mm。測量各個信號所用的積分時間，最后在用式（9）計算光譜時將所有的信號歸一到1ms。

（四）討論

由于無法完全避免來自立方體內表面的反射光，因此透鏡測量時背景信號所占的比例較大，同時也限制了光譜測量的積分時間。這個問題可以通過采用片狀和楔狀分束器來解決，但表面平行的片狀分束器會帶來由兩表面的反射光相互干涉形成的光譜周期結構，從而干擾光譜分析；而兩表面有小角度夾角的楔形片狀分束器會使得光學系統的同軸調整變得復雜。

從另外一個方面來看，光纖探頭測量不僅具有實驗系統簡單、易于操作的優點；而且當設置測量高度足夠遠、溶液厚度足夠小的時候，背向散射角的定義也會變得更加明確，但這些設置也會導致信噪比的降低。光纖探頭光譜測量的局限性在測量微米量級的顆粒時存在，但對亞微米顆粒的測量可以忽略。

三、結論

本文通過理論分析和實驗驗證，細致地比較了光纖探頭測量和透鏡系統測量這兩種背向散射光譜獲取方法的優缺點。實驗結果表明，在提取微米球形顆粒尺寸時，前一種方法簡便易行，但所獲得的光譜形狀會受到測量高度以及顆粒溶液厚度的影響；后一種方法中不存在這些問題，但其光譜測量的信噪比較低。因此，在顆粒尺寸提取精度要求不高的情況下，可以選用光纖探頭測量方法；在精度要求高時，應選用透鏡測量方法，同時采用濾波去噪聲信號處理的手段來提高顆粒尺寸的提取精度。下一步研究將集中于如何提高透鏡系統光譜測量的信噪比，一種可能的途徑是用反射凹面鏡來取代透鏡，這樣可以在系統中避免使用光分束器，在提高信噪比的同時保留透鏡系統測量的優點。

參考文獻：

[1]用于亞微米顆粒測量的后向散射光譜法[J].楊依楓，楊暉，鄭剛，劉國斌，邢世通.光子學報. 2011（11）