稠油降解菌的篩選與降解效果評價

鄭克華，趙 陽，隋殿雪，楊 磊

（1. 東北石油大學 提高采收率重點實驗室，黑龍江 大慶 163318； 2. 大慶油田第四采油廠，黑龍江 大慶 163318）

稠油降解菌的篩選與降解效果評價

鄭克華1，趙 陽1，隋殿雪2，楊 磊1

（1. 東北石油大學 提高采收率重點實驗室，黑龍江 大慶 163318； 2. 大慶油田第四采油廠，黑龍江 大慶 163318）

微生物驅油技術的主要機理之一就是利用微生物降解原油中含有大組分，降低原油粘度，進而改變原油的物性。利用原油以及含油污水中篩選出能降解稠油的菌組進行實驗，結果表明，微生物作用使原油物性發生明顯變化，原油中的膠質、瀝青質含量降低，組分也發生了明顯變化，原油物性變化明顯。

稠油降解菌；粘度；菌數；組分

稠油是21世紀重要的后備戰略資源，在經濟上也有著非常重要的地位。我國的稠油資源含量較大，隨著對稠油資源的重視以及開發力度的加大，針對稠油的生物降解研究日益增多。國內外關于稠油微生物開采的機理研究有很多，總的來說，主要是因為微生物或其代謝產物對稠油的降粘作用[1]。微生物對稠油的降解主要是能夠降解大分子烷烴，使其變為小分子烴化合物，也就是利用微生物把稠油中的高分子物質如蠟質、膠質、瀝青質分解為低分子量的化合物，降低整個稠油的平均分子量，使稠油粘度下降[1]。

迄今為止，已探明能夠降解石油的微生物有190多種，其中細菌有假單胞菌屬、棒桿菌屬、產堿桿菌屬等。然而由于稠油組成復雜，難降解物質較多，對稠油的降解作用并不理想，表現為處理周期長，降解率低[2-4]。本實驗對油田現場油井采出水中的4種降解菌進行分離純化，從中篩選出對稠油有較好降解效果的菌株，并對其降解效果進行研究。

1 實驗部分

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

實驗選用菌種樣品取自于油田現場油井采出水中，從中分離并純化得到4株純菌株。

1.1.2 實驗中培養基的制備

（1）分離及純化用培養基

牛肉膏蛋白胨平板培養基的制備需要瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉等物質在中性條件下配置[3]。

葡萄糖平板培養基的制備需要瓊脂、葡萄糖、玉米漿、硝酸鈉、十六水磷酸氫二鈉、五水硫酸鎂、氯化鈣等物質在中性條件下配置[3]。

（2）降解菌篩選培養基

種子瓶培養基的制備需要葡萄糖、玉米漿、硝酸鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氯化鈣等物質在中性條件下配置[4]。

發酵瓶培養基的制備需要：葡萄糖、玉米漿、硝酸鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氯化鈣在中性條件下配置[4]。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離與純化

（1）涂布培養

我們將其分為三部分：樣本稀釋，涂布，恒溫培養。通過樣本稀釋的的過程我們可以得到稀釋度為10-6的稀釋液；用無菌刮刀將得到的稀釋液均勻的涂到培養基表面并將其分為三組平行樣本；最后等培養基將平板表面液體吸收后，將其放到35 ℃恒溫箱中培養。

（2）劃線培養

采用交叉劃線法 ，首先從1至6依次進行。其次，我們將劃線后的平板倒放于35 ℃培養箱中進行培養，培養3 d。最后，我們選取單菌落進行鏡檢。

（3）鏡檢

我們將過程分為三部分：涂片，染色，顯微鏡觀察。從上述三步中我們得到需要的純菌種以便下面實驗的進行。

1.2.2 降解菌的篩選

（1）種子培養

首先將得到的純菌株接入經過滅菌后的種子瓶中，將瓶子放在35 ℃、150 r/min的搖床中，震蕩培養 15～16 h。然后取出放在超凈工作臺上，測定其pH，并觀察菌株生長情況。選擇純菌株并且生長狀況良好的種子液接種放入無菌發酵瓶中。若菌種生長狀態基本一致，根據種子液 pH選擇，以 7.2為最佳[5]。

（2）發酵培養

取10 mL的種子液接種放入發酵瓶中，放入35℃、150 r/min的搖床，振蕩培養2～3 d。

（3）總菌數的測定方法

本實驗采用平板計數法。首先，采用100倍系列稀釋法，將待測樣品逐級稀釋，取稀釋度為10-5、10-7、10-79的稀釋液0.2 mL于葡萄糖平板培養基上涂布均勻。然后，置于35 ℃的溫箱中培養24 h后取出計數，根據式1計算出總菌株[5]。

每毫升中總菌株=同一稀釋度兩組平行樣的菌落平均數×稀釋倍數×100，不同稀釋度計算得到的總菌株不能相差太大，否則，視為檢驗不準確。

1.2.3 降解效果的評價

實驗稠油取自油田現場油井。試驗溫度為 35℃，將培養基與稠油接種微生物混合，在150 r/min的搖床上發酵8 d。觀測菌株生長分裂情況，繪制菌株生長曲線，并檢測這一過程中的菌數及pH值的變化。取微生物作用前后的稠油測定稠油粘度、族組分，進行全烴色譜分析，研究微生物對稠油的作用效果[6]。

2 結果與討論

2.1 菌株的分離與純化結果

通過涂布、劃線培養，共得到4株內源純菌株：1#、2#、3#、4#，石油降解菌經鑒定分屬假單胞菌屬和芽孢菌屬。

2.2 降解菌的篩選結果

篩選得到生長較好、性狀比較穩定的降解菌 4株，5#、6#、14#、16#。分別設置平行樣命名為 5（1）#、5（2）#、6（1）#、6（2）#、14（1）#、14（2）#、16（1）#、16（2）#。其中，5#為粗短桿菌，6#為細小短桿菌，14#為球菌，16#為大球菌。

觀測4株稠油降解菌生長代謝過程中的菌數變化，繪制菌株的生長曲線，如圖1所示。

圖1 各菌株的生長曲線Fig.1 Growth curve of each strain

通過培養，發現 6#、16#菌株在發酵過程中，總菌株較高，2-3d內均能維持在108個/mL以上，并且菌數波動較穩定。而其余菌株的生長狀況較差，整個過程中總菌株都不高（圖 1）或者波動幅度很大。由于 6#、16#菌株的生長能力優于其它菌株因此將6#、16#作為稠油降解菌株保留備用。

從6#、16#菌株的種子瓶中取5 mL接入發酵瓶，在35 ℃、150 r/min的搖床中培養8 d，得到菌株的發酵曲線，如圖2、圖3所示。并取微生物作用前后稠油測定粘度，實驗溫度50 ℃，表1列出了微生物作用前后稠油粘度變化的數據。

圖2 6#菌株發酵曲線Fig.2 Fermentation curve of 6# strain

圖3 16#菌株發酵曲線Fig.3 Fermentation curve of 16# strain

表1 微生物作用前后稠油粘度Table 1 Crude oil viscosity before and after microbial action

由圖3發酵曲線知，菌株在發酵瓶中的生長大體可分為三個階段。

第一階段為生長初期，生物量不斷增加，pH變化加快，產物逐漸增加。

第二階段為生長活躍期，總菌株逐漸達到最大值并趨于穩定，pH變化平緩，菌株代謝活力最強[6]。

第三階段為生長后期，pH逐漸下降，菌體開始衰亡，菌數減少。

通過發酵曲線可以看出，6#菌株生長代謝過程中的總菌數高于16#菌株。并且，由于6#菌株的pH值在發酵過程中不易受到發酵條件的干擾，波動較小。同時，根據微生物作用前后稠油的粘度變化可以看出，6#降粘率85.9%，16#降粘率74.9%，6#的降解率大于16#，即6#的降解效果優于16#的降解效果。因此，選擇6#菌株作為石油烴降解菌，接種至斜面保存。

2.3 微生物菌種的降解效果評價

篩選出的微生物，以大分子碳鏈的烴類化合物作為營養物質，同時將大分子轉化為小分子組分排出體外，達到稠油降解的目的[7]。我們從稠油降解菌的篩選及微生物作用后稠油物化性質的改變情況，對6#菌作用前后稠油組分進行了色譜分析，結果見表2。

表2 微生物使用前后稠油組分變化Table 2 Change of crude oil before and after using bacteria

從表2中可以看出，經6#菌作用后稠油組分中非烴類以及芳烴類含量均發生變化。分析表明微生物已經將稠油降解，稠油流動性增強。

3 結 論

（1）從油田現場油井采出水中分離純化得到4株降解菌，其中 6#、16#菌株發酵過程中的總菌數較高，初步篩選得到兩株菌株6#和16#。

（2）在發酵瓶中，6#、16#菌株的生長大致經歷了三個時期：生長初期、活躍期、生長后期。在生長活躍期，菌體代謝活力最強，

（3）微生物繁殖能力較強。經微生物作用后的稠油物性變化較大，大分子烷烴降解成小分子烷烴，稠油粘度也顯著的降低[8]。

（4）6#菌株的降解能力優于 16#菌株，且 6#菌株不易受到發酵條件的干擾，因此6#菌株更適用于工業發酵培養。

［1］張廷山，蘭光志，鄧莉,等.微生物降解稠油及提高采收率實驗研究[J].石油學報，2001，22(1)：54-57．

［2］伏亞萍，李魚，王健，曹周禮，段勇，郭書海.稠油降解菌的篩選及其生物表面活性劑的特征[J].吉林大學學報(理學報)，2007，45(1)：148-152．

［3］賈群超，郭楚玲，盧桂寧，易筱筠，楊琛，黨志.兩株稠油高效降解菌的篩選鑒定及其降解性能研究[J].環境工程學報，2011，5(5)：1181-1186．

［4］張金波,等.微生物降粘提高采收率技術初探[J].鉆采工藝，2003，26(4)：92-94.

［5］袁紅莉，楊金水，王占生等.降解石油微生物菌種的篩選及降解特性[J].中國環境學，2003，23(2)：157-161．

［6］Atlas R M .Microbial Degradation of Petroleum Hydrocarbons Biore mediation of Oil Spills[J].Chemistry Technology of Fuel and Oils，1 991，52：149-156．

［7］Kubota K ，Koma D，Matsumiya Y，et al.Phylogenetic analysis of long-chain hydrocarbon-degrading bacteria and evaluation of their hydrocarbon-degradation by the 2，6-DCPIP assay[J].Biodegradation，2008，19(5)：749-757．

［8］Aoshima H，Hirase T，Tada T，et al.Improvement of heavy oil degradation by Rhodococcus erythropolis C2[J].Journal of Environ mental Biotechnology，2006，5(2)：107-109．

Screening of Thick Oil-degrading Bacteria and Its Degradation Effect

ZHENG Ke-hua1,ZHAO Yang1,SUI Dian-xue2,YANG Lei1

（1. Northeastern Petroleum University, Heilongjiang Daqing 163318，China; 2. Daqing Oilfield Company No.4 Oil Production Plant, Heilongjiang Daqing 163318, China）

One of the main mechanisms of microbial oil recovery technology is to reduce the viscosity and freezing point of crude oil by using microbial degradation of the main components such as gum and asphaltene in crude oil, so as to improve the physical and chemical properties of crude oil.In this paper,the experiment was carried out to isolate and select the bacteria to effectively degrade the heavy oil.The results show that the properties of heavy oil have been changed obviously with the action of bacteria, and the contents of each component in the heavy oil are decreased, and the composition and structure of the heavy oil are changed obviously.

Thick oil-degrading bacteria; Viscosity; Bacterial count; Component

TE 357

A

1671-0460（2017）04-0633-03

2017-02-26

鄭克華（1990-），男，山東省濟寧市人，碩士研究生，東北石油大學石油工程學院，研究方向：提高油氣采收率。E-mail：1009621146Qqq.com。