座滴法制備雞蛋白溶菌酶晶體與生長因素探究

張曉婷，唐建國*，張 羽，王 瑤，黃林軍，劉繼憲，王彥欣，張曉琳，李 瀟，Matt J. Kipper, Christopher D. Snow*

（1. 國家雜化材料技術國際聯合研究中心，國家高分子雜化材料國際合作基地，青島大學雜化材料研究院，青島大學材料科學與工程學院，山東 青島266071; 2. 科羅拉多州立大學化學與生物工程學院，科羅拉多 柯林斯堡80523，美國）

科研與開發

座滴法制備雞蛋白溶菌酶晶體與生長因素探究

張曉婷1，唐建國1*，張 羽1，王 瑤1，黃林軍1，劉繼憲1，王彥欣1，張曉琳1，李 瀟1，Matt J. Kipper2, Christopher D. Snow2*

（1. 國家雜化材料技術國際聯合研究中心，國家高分子雜化材料國際合作基地，青島大學雜化材料研究院，青島大學材料科學與工程學院，山東 青島266071; 2. 科羅拉多州立大學化學與生物工程學院，科羅拉多 柯林斯堡80523，美國）

蛋白質晶體學的不斷發展，使得蛋白質晶體的結晶方法也日趨增多。首次采用了座滴法結晶法，探究不同濃度雞蛋白溶菌酶溶液，不同溫度、NaCl濃度，是否添加mPEG對晶體形貌尺寸的影響。通過顯微鏡以及掃描電鏡觀察蛋白質晶體形貌特征，不同條件下的晶體形貌變化，最終獲得晶體生長的最適溫度以及濃度條件。

雞蛋白溶菌酶（HEWL）晶體；座滴法結晶；溫度；沉淀劑濃度；mPEG

尋找蛋白質結晶的最適生長條件和晶體生長方法，一直以來是晶體培養領域的目標。在某種程度上來說，晶體的生長是科學理論與長久的經驗積累得出的[1]。結晶方法的不同也會產生不同的蛋白質晶體。大多數的蛋白質晶體培養多采用以下幾種方法結晶。

氣相擴散法，主要有懸滴法（The Hanging Drop Method）和座滴法（The sitting-drop method）兩種[2-4]。相對于分批法，蛋白質溶液緩慢地形成過飽和溶液，晶體生長的速度可控[5]。懸滴法中，蛋白質與沉淀劑液滴置于處理后的蓋玻片上，凹槽中放置沉淀劑。蓋玻片反置于生長盤的凹槽之上，油酯密封[6]。但在懸滴法中，如果液滴表面張力過小，會在蓋玻片表面展開，導致濃度的分布不均，無法獲得晶體[7,8]。

本實驗采取座滴法，可以直接使用顯微鏡觀察，無需處理蓋玻片，蛋白質液滴不會鋪展開。減弱了晶體在懸滴法中受到的重力影響[9]。晶體長成后，便于轉移與交聯。該方法需要的蛋白質較少，這對于探究晶體生長條件十分方便。在蛋白質晶體培養時，溶菌酶是常用的蛋白質，而雞蛋白溶菌酶(Hen-egg white Lysozyme簡稱HEWL)，是溶菌酶群中重要的研究對象，而HEWL是第一個三維結構已知的酶[10]。HEWL化學性質穩定，在pH=4～7范圍內，100 ℃處理1 min仍保持原酶活性，在堿性環境中該酶對熱穩定性較差，但交聯后的晶體耐強酸或強堿以及高溫等極端化學環境[11]。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

所用化學試劑均為分析純，離心后去除雜質。醋酸鈉，醋酸，氯化鈉,戊二醛（≥50%）均購于上海國藥集團化學試劑有限公司，聚乙二醇單甲醚5000（mPEG-5000）購于上海阿拉丁試劑有限公司。雞蛋白溶菌酶（HEWL）、晶體生長液（30%w/v mPEG5000, 1.0 mol/L NaCl, 0.05 mol/L NaAc pH4.6）與 24孔坐滴晶體生長盤以及透明晶體密封膠帶均購于Hampton research 公司。

所用到的儀器有德國 Brand 數字可調式單道移液槍（量程范圍2～20μL），梅特勒恒溫磁力攪拌器，重慶奧特體視連續變倍顯微鏡，TGL-16M湘儀冷凍離心機，掃描電子顯微鏡（JSM-7500F日本電子株式會社），雷磁pH計。

1.2 雞蛋白溶菌酶(HEWL)溶液的配制

在室溫下，使用pH配制pH=6.4的0.05 mol/L的醋酸鈉-醋酸緩沖液作為溶劑。配制20、30、40、50 g/L的HEWL的醋酸鈉溶液。

1.3 晶體生長沉淀劑的制備

本實驗使用的晶體沉淀劑分別為購于 Hampton research的晶體生長液，以及不同濃度的NaCl、不同pH的NaAc、聚乙二醇單甲醚（mPEG）混合溶液，配制濃度為4 mol/L的NaCl溶液，0.1 mol/L的pH 4.6 NaAc溶液，母液稀釋法配制不同NaCl濃度的沉淀劑。

1.4 座滴法制備雞蛋白溶菌酶(HEWL)晶體

一定濃度的 HEWL的醋酸鈉溶液，吸取大于100μL的沉淀劑于B中，1～10μL 的HEWL蛋白質溶液于A中，并從B中1～10μL沉淀劑于A中，使得A中蛋白質溶液與沉淀劑形成過飽和溶液，膠帶密封，恒溫靜置生長。待晶體生長完成后，加入少量戊-二醛溶液密封交聯，長期保存(圖1)。

1.5 不同溫度下的晶體生長

按照表1制備HEWL的醋酸鈉溶液。在15、25、30 ℃下，生長晶體。沉淀劑中還含有30%w/v MPEG、0.05 mol/L NaAc pH=4.6。

圖1 座滴法晶體生長裝置Fig.1 Sitting-drop method device

表1 不同溫度下晶體生長條件Table 1 Crystal growth conditions at different temperatures

1.6 不同NaCl濃度下晶體生長

按照表2配制沉淀液，在25 ℃下，選擇40 g/L HEWL溶液，生長晶體。

表2 不同濃度的NaCl溶液Table 2 Different concentrations of NaCl solution

1.7 mPEG-5000對晶體生長的影響

對表2中的NaCl溶液，添加30%w/v 的mPEG。在25 ℃下，40 g/L的HEWL溶液，生長晶體。

2 結果與討論

2.1 雞蛋白溶菌酶晶體（HEWL）表征

圖2a中，HEWL晶體為六方晶體和四方晶體，無色透明，有明顯的邊界。選取四方晶體進行洗滌交聯后，晶體由無色透明，變為透明淺黃色。戊二醛與蛋白質中氨基結合，發生了分子間交聯，蛋白質變性[12,13]，晶體結構穩定性增強，可以承受高能電子束掃描。圖2c和圖2d為晶體的SEM測試圖，在HEWL晶體中，存在大量水通道，在樣品制備過程中，真空干燥使HEWL晶體表面發生了失水皺縮，HEWL晶體內部蛋白質濃度升高，可以觀察到晶體表面析出新的 HEWL蛋白質，產生新的小尺寸HEWL片晶[14-17]。

圖2 a、b為晶體交聯前與交聯后的顯微鏡圖片; c、d為晶體的掃描電鏡圖片Fig.2 a b for the crystal before and after crosslinking microscope pictures, c d for the SEM image of the crystal

2.2 溫度對HEWL晶體生長的影響

圖3可見，低溫下，成核迅速，但生長速度低，產生大量的微晶。溫度升高，晶體成核慢，生長速度快，產生大尺寸的不規則晶體。在 15 ℃時，發現低濃度的蛋白質溶液會產生小尺寸的晶體，產生了孿晶[18]。

該溫度下 HEWL溶液迅速達到飽和或過飽和狀態，導致晶核成核快，晶核數目多，晶體尺寸變小。25 ℃，HEWL在濃度20～40 g/L時，晶體的形貌大多為規則的四方晶體，存在極少的孿晶，隨著蛋白質濃度增加，晶體尺寸逐漸增大。在 30 ℃，溫度過高，形貌發生變化，晶體為尖銳的星型，晶體數量隨著濃度的增大而增多。當HEWL溶液濃度達到50 g/L時，均由于濃度過大，導致晶核數目過多，無大尺寸晶體生成[18-20]。

圖3 15 ℃時HEWL濃度分別為20 ～ 50 g/L的HEWL晶體（a-d）；25 ℃時HEWL濃度分別為20 ～ 50 g/L HEWL晶體（e-h）；30 ℃時HEWL濃度分別為20 ～50g/L HEWL晶體（標尺均為100 μm）Fig.3 HEWL in 20 g/L to 50 g/L crystals at 15 ℃(a-d); HEWL in 20 g/L to 50 g/L crystals at 25 ℃(e-h); HEWL in 20 g/L to 50 g/L crystal at 30 ℃(scale = 100 μm)

可以得出結論，溫度低于25 ℃，晶體生成數目會隨蛋白質溶液濃度升高而增多，因低溫迅速結晶而產生孿晶。而溫度高于25 ℃，晶體生長會發生晶體變形，晶核生長過程因升溫而加速，晶核無法良好的生長，形貌發生改變。因此溫度過高或過低都無法得到形貌良好的晶體[21]。

2.3 不同NaCl濃度下晶體生長

圖4可以看出，NaCl濃度影響晶體的生長，隨著NaCl濃度的增加，晶體尺寸由小增大，尺寸分布呈現曲線變化，晶型為棒狀晶。在濃度為1.3 mol/L時，棒狀晶體的數量減少，長徑比增大，晶體尺寸增大。在d圖中，NaCl濃度過大，導致晶核增多，晶體無法繼續生長，棒狀晶體的尺寸減小，易斷裂。晶體在濃度為1.3 mol/L時達到最佳，濃度繼續增大，則晶體會由于沉淀劑濃度增大，晶核增多，無法形成完美晶型的四方晶體。過飽和的蛋白質溶液可以經過熱力學誘導而分離成2個介穩的濃度相差較大的液相，即不穩定區(labile region)和亞穩區(metastable region)。由圖4f中蛋白質晶體生長相圖來看，晶體生長需要達到高的過飽和度，如果過飽和度太小，成核速率慢，晶體未生成，這個狀態為亞穩區。在非穩區或者結晶區的任一點，溶液自發結晶，在溫度不變時，溶液濃度會逐漸下降，直至飽和線界限。因此，溶液需要在亞穩區或非穩定區才能結晶。當濃度繼續增大，達到沉淀區，會產生無序結構，造成大量晶核生成。因而蛋白質溶液與NaCl溶液的濃度需要在非穩區范圍內。

圖4 25 ℃下，40 g/L HEWL溶液，HEWL晶體（無mPEG，標尺均為100 μm）Fig.4 25 ℃, 40 g/L HEWL, HEWL crystals (no mPEG, scale are 100 μm)

2.4 mPEG對晶體生長的影響

對比圖4，可以發現圖5晶體的形狀由棒狀晶體變為四方晶體，晶體尺寸均一、形狀規則。晶體的生長過程中會受到液相流動的影響，導致晶體發生變形以及晶格缺陷增多，也會使得晶體無法生成。圖5在晶體生長的沉淀劑中加入mPEG后，溶液粘度增大，降低了體系流動性和晶體生長速度，晶體不易變形。

圖5 加入30%w/v mPEG后，不同NaCl濃度生長出的晶體Fig.5 After adding 30%w/v mPEG, HEWL crystallization of different NaCl concentration

3 結 論

座滴法（the sitting-drop method）結晶法，改進了懸滴法中對于玻片的硅化過程，避免了蛋白質溶液液滴表面張力不足而導致的平鋪在玻片表面，同時更加方便利用顯微攝像技術記錄檢測蛋白質晶體情況。HEWL蛋白質晶體的生長過程受溫度、濃度、以及mPEG的影響,晶體生長存在最佳環境條件，本體系在溫度為25 ℃,NaCl濃度處于1.1～1.5 mol/L之間，且加入mPEG的條件下，可以獲得形狀尺寸良好的HEWL四方晶體。

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科思創一季度凈利潤4.68億歐元 聚氨酯業務表現強勢

科思創于4月25日公布了其第一季度財報。數據顯示，公司第一季度凈利潤由去年同期的1.82億歐元飆升至4.68億歐元。其中，聚氨酯業務呈現出的三倍增長起到了至關重要的作用。

截至2017年3月，公司第一季度營業額為35.9億歐元，同比增長24.7%，息稅折舊及攤銷前利潤也強勢上行近66.5%，達到了8.46億歐元。第一季度營業利潤為6.88億歐元，較去年同期的3.4億歐元上漲一倍有余。

科思創首席執行官Patrick Thomas對此贊譽有加：“公司展現出了強勁的增長勢頭，其息稅折舊及攤銷前利潤也已連續九個月處于上行軌道之中。”

科思創聚氨酯業務第一季度營業利潤從去年同期的1.17億歐元躥升至3.96億歐元，營業額也上漲35%，達18.9億歐元。其中，聚碳酸酯業務營業利潤為 1.84億歐元，較去年同期漲幅達 44.9%。涂料、膠黏劑以及各類特殊化學品業務利潤也小漲3.4%，收于1.23億歐元。

據科思創宣稱，第一季度銷售額所顯現出的 24.7%的增長是由多項因素共同推動的，比如第一季度總銷售量與平均銷售價格分別上升了9%與13.4%，以及聚氨酯售價抬升25.8%等。

科思創首席財務官Frank Lutz對此表示：“公司第一季度的活躍表現更堅定了我們對整個2017財年的信心。其原因顯而易見——全球建筑業以及北美與亞太地區家具、床墊業的市場需求日益增長，無疑為公司第一季度的迅猛增長提供了動力。”

科思創曾與2015年宣布永久關閉位于西班牙塔拉戈納的MDI裝置，這一計劃在公布后隨即擱淺。若非科思創維持裝置運轉至今，也不會有當下的一片欣欣向榮。

同時，科思創早在2016年6月就計劃對位于德國北部城市布倫斯比特爾的一處工廠進行改建，力爭到2018年實現產能倍增。屆時，該廠MDI年產能將達到40萬噸每年。

盡管科思創并未在周二的報告中公布具體數字，但有關人士稱：第一季度的成功極大提振了公司在實現原定營銷目標方面的信心。據預測，與過去三年平均水準相比，公司2017年度凈現金流將呈現出較為明顯的漲幅。

Study on Growth Factors of Hen-Egg White Lysozyme Crystallization by Sitting-drop Method

ZHANG Xiao-ting1,TANG Jiang-guo1*,ZHANG Yu1,WANG Yao1,HUANG Lin-jun1,LIU Ji-xian1,WANG Yan-xin1,ZHANG Xiao-lin1,LI Xiao1,Matt J. Kipper2,Christopher D. Snow2*

（1. The National Base of International Scientific and Technological Cooperation on Hybrid Materials, The International Cooperation Base of National Polymer Hybrid Materials, Institute of Hybrid Materials of Qingdao University, Department of Material Science and Engineering, Qingdao University, Shandong Qingdao 266071，China；2. Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado State University Colorado Fort Collins, CO 80523, USA）

The development of protein crystallography promotes the improvement of crystallization method of protein crystals. In this paper, effect of hen egg white lysozyme concentration, temperature, NaCl concentration and adding mPEG or not on size and pattern of protein crystals was investigated. The crystal morphology of the protein was observed by microscope and Scanning Electron Microscope, and the optimum temperature and concentration conditions were obtained in the end.

Hen-egg white lysozyme crystals; Sitting-drop method; Temperature; Concentration of precipitant；MPEG

O 743

A

1671-0460（2017）04-0573-04

(1)國家自然科學基金(#51273096，#51373081，#51473082);

(2)國家高端外國專家項目(GDW20143500164, GDT20153500059, GDW20143500164)；

(3)國家重點研發計劃“政府間國際科技合作”重點專項(2016YFE10800) ;

(4)國家創新引智計劃“111計劃”。

2017-03-13

張曉婷（1992-），女，山東省濰坊市人，研究生，碩士，2017年畢業于青島大學材料學，研究方向：蛋白質晶體稀土雜化材料。E-mail：17864215552@163.com。

唐建國（1958-），男，教授，博士，高分子雜化材料研究。E-mail：jianguotangde@hotmail.com。