仿刺參精酶解工藝條件優化及體外抗氧化

張 健,劉少偉,張 毅,王共明,趙云蘋,劉京熙,井月欣,劉 芳

(1.華東理工大學,生物工程學院,生物反應器國家重點實驗室,上海 200237;.中國科學院上海生命科學研究院,上海 200233;3.山東省海洋資源與環境研究院,山東煙臺 264006)

仿刺參精酶解工藝條件優化及體外抗氧化

張 健1,2,3,劉少偉1,*,張 毅2,王共明3,趙云蘋3,劉京熙3,井月欣3,劉 芳3

(1.華東理工大學,生物工程學院,生物反應器國家重點實驗室,上海 200237;.中國科學院上海生命科學研究院,上海 200233;3.山東省海洋資源與環境研究院,山東煙臺 264006)

本研究以仿刺參精(Apostichopusjaponicusspermary,ASJS)為材料,以水解度為指標優化了酶解工藝條件,并考察了酶解產物的體外抗氧化效果。實驗選用木瓜蛋白酶(PAP)、復合蛋白酶(PRO)和風味蛋白酶(FLA)作為實驗用酶,以雙縮脲法結合三氯乙酸法測定水解度,通過單因素與正交實驗,優化了單酶酶解工藝條件,并與雙酶及三酶復配水解進行了比較實驗,最后對不同的水解產物進行了體外抗氧化活性測定。結果表明:單酶最佳酶解工藝條件為PAP:酶添加量3.0%、溫度70 ℃及反應時間4 h;PRO:酶添加量3.0%、溫度45 ℃及反應時間4 h;FLA為:酶添加量2.0%、溫度45 ℃及反應時間4 h。在最佳酶解工藝條件下PAP水解度為32.14%,PRO為31.09%,FLA為11.89%。雙酶及三酶的復配水解工藝檢測到的水解度均低于單PAP及單PRO。不同水解產物清除羥自由基和超氧陰離子自由基能力結果為,在樣品濃度為5 mg/mL和10 mg/mL時,ASJS的PAP酶解產物好于PRO、FLA、雙酶、三酶復配,同時也好于仿刺參卵及體壁PAP酶解產物。綜上可知,ASJS的PAP水解產物顯示出較好的體外抗氧化活性,可以進一步開發利用。

仿刺參精,酶解,正交優化,抗氧化

海參營養成分豐富,是高蛋白低脂肪的營養滋補品[1],含有膠原蛋白、多糖、多肽、皂苷、脂肪酸等多種活性成分,其中如海參多糖具有抗腫瘤、抗凝血及降血脂等活性[2-4],海參皂苷具有抗真菌、抗腫瘤及提高免疫等活性[5-6],海參肽具有抗疲勞、抗氧化及鎮痛等活性[7-8]。

海參加工過程中通常產生大量的副產物,如海參腸道、海參卵和海參精等,已有研究表明,這些加工副產物同樣含有豐富的營養成分[9-10],其中海參精是海參的雄性生殖腺組織,營養成分豐富,是高蛋白低脂肪的營養品,其蛋白質和氨基酸含量很高,不飽和脂肪酸及礦物元素含量也很豐富[11]。開展海參副產物的加工利用研究,將促進開發新的海參制品,節約資源,繁榮市場,企業增效。

仿刺參精作為海參加工過程的副產物,營養價值很高,但是開發利用程度較低,以此為原料的研究結果也較少,本實驗以新鮮ASJS為研究對象,從幾種常用中性蛋白酶中優化出最佳酶解工藝條件,并對多種水解產物的抗氧化活性進行了比較研究,為開發制備新型抗氧化活性物質提供了素材。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮仿刺參生殖腺 煙臺華康海洋食品有限公司;木瓜蛋白酶(PAP) 南寧龐博生物工程有限公司;風味蛋白酶(FLA)與復合蛋白酶(PRO) 丹麥諾維信公司;抗氧化(清除羥自由基及超氧陰離子)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;牛血清清蛋白標準溶液 生工生物工程上海股份有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

Kjeltec 2300型全自動凱氏定氮儀 丹麥Foss公司;AR1140電子天平 美國Ohaus公司;高速離心機 德國Eppendorf有限公司;TU-1810DASPC分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;恒溫水浴鍋 常州中捷實驗儀器制造有限公司;JMF-365膠體磨 煙臺星火輕工機械設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解工藝流程 新鮮仿刺參→顯微鑒定分出ASJS→清洗瀝干→勻漿→加蛋白酶酶解→滅酶→高速離心→取上清液待測

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 總蛋白質含量測定 凱氏定氮法[12]。

1.2.2.2 可溶性蛋白的測定 使用雙縮脲法,具體操作如下:配制0、2、4、6、8、10、12、14 mg/mL的牛血清清蛋白標準溶液,將標準溶液1 mL與雙縮脲試劑4 mL混勻反應,在室溫(20～25 ℃)下靜置30 min,在540 nm下測定吸光度,繪制的標準曲線;樣品中可溶性蛋白含量的測定參照上述步驟操作,通過回歸方程計算求得樣品中可溶性蛋白含量[13]。

1.2.2.3 水解度的測定 使用三氯乙酸(TCA)法。取酶解液5 mL與TCA(質量分數為10%)5 mL充分混勻,靜置10 min,然后以10000 r/min離心10 min,以雙縮脲法測定上清液中可溶性蛋白含量,以凱氏定氮法測ASJS中總蛋白含量[14]。按照下式計算水解度(%)。

式中:N1為反應后ASJS酶解液中可溶性蛋白含量(mg/mL);N2為反應前ASJS中可溶性蛋白含量(mg/mL);N0為ASJS中總蛋白含量(mg/mL)[15]。

1.2.3 單因素實驗 選擇PAP、PRO和FLA三種最適pH為中性范圍的蛋白酶,分別對三種酶的溫度、酶添加量和反應時間3個因素進行考察。根據文獻并結合酶制劑說明書制定三種酶的單因素實驗條件為:溫度:40、50、60、70、80 ℃;酶添加量:0.5%、1%、2%、3%、5%;反應時間:1、3、5、7、9 h[16-17],不變的條件為PAP:溫度70 ℃,PRO和FLA溫度:50 ℃,酶添加量均為:3%,反應時間均為5 h。

1.2.4 正交實驗設計 經過單因素實驗后,繼續考察溫度、酶添加量和反應時間對水解度的影響,采用正交實驗設計對工藝條件進行優化,得出三種蛋白酶各自最優的水解工藝。實驗設計采用L9(34)正交表,PAP因素水平表如表1所示,PRO和FLA因素水平表如表2所示。

表1 正交因素水平表

表2 正交因素水平表

1.2.5 多酶復配的比較實驗 通常蛋白酶因為酶切位點及作用方式的不同,具有不同的水解效果。參照前期的研究[18],對ASJS雙酶及三酶復配進行實驗。雙酶復配實驗采用PAP、PRO及FLA兩兩復配同時加入的方式進行。三酶水解方式為先用雙酶(PAP與PRO)在溫度70 ℃,酶添加量各1%條件下水解4 h,煮沸滅活后,間隔2 h再添加FLA繼續水解,FLA水解條件為:溫度45 ℃,酶添加量1%,反應時間1 h,酶滅活后測定其水解度。最后比較單酶、雙酶及三酶復配的水解實驗效果[18]。

1.2.6 體外抗氧化活性研究 經過ASJS酶解工藝條件優化后,使用一定的酶添加量,在各自最適宜溫度下反應一定的時間,制備出多種ASJS水解產物。同時,采用與ASJS的PAP酶解相同步驟,對仿刺參卵和體壁進行水解,制備出仿刺參卵PAP水解產物和體壁PAP水解產物,制備采用的水解條件統一為酶添加量3%、時間5 h及各自最適溫度,共制備出9種不同的水解產物。對這幾種水解產物進行體外抗氧化(清除羥自由基和超氧陰離子)活性的測定。

1.2.6.1 清除羥自由基能力測定 使用羥自由基測定試劑盒,根據試劑盒操作說明測定不同水解產物清除羥自由基能力。

1.2.6.2 清除超氧陰離子自由基測定 使用清除超氧陰離子自由基測試盒,根據試劑盒操作說明測定不同水解產物清除超氧陰離子自由基能力。

1.2.7 數據處理與統計分析 采用Excel 2007軟件整理數據,SPSS 22. 0軟件進行正交實驗設計及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 可溶性蛋白標準曲線

按照雙縮脲法標準曲線的制作步驟,繪制的標準曲線如圖1所示。由圖可以看出,經線性回歸分析,雙縮脲法測量牛血清清蛋白時,當蛋白質含量在0～12 mg/mL時,線性關系最好,標準曲線方程為y=0.0459x+0.0108(R2=0.9996)。

圖1 雙縮脲法標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

2.2 ASJS酶解單因素實驗結果

2.2.1 不同溫度下ASJS水解度結果 由圖2可知,隨著溫度由低到高,使用PAP組的水解度逐漸升高,當溫度上升到70 ℃時,水解度達到30%左右。溫度繼續升高,水解度依然有所提高,推測原因在于PAP的適宜溫度范圍在10～85 ℃,在70～80 ℃仍存在一定的水解活力;另外推測,較高的反應溫度可能激活了ASJS材料自身含有的自溶酶,進一步對精蛋白進行了水解,使得測定的水解度呈現出升高的現象,這與之前的相關研究結果類似[19]。綜合考慮加熱成本,水解度等因素后,確定進一步對PAP反應溫度在70 ℃左右進行考察。

PRO是一種桿菌蛋白酶復合體,低添加量時也可以產生沒有苦味的水解液,FLA是一種蛋白酶/肽酶復合物,在酶活力方面具有內切和外切兩種作用;不同溫度對PRO與FLA水解度的作用結果基本一致,均是隨著溫度逐漸提高,水解度出現先升高后下降結果,在80 ℃時出現回升情況,推測也是高溫下自溶酶作用的結果[19]。根據實驗結果,且參考各自最適溫度范圍,確定對PRO與FLA反應溫度在50 ℃左右進一步優化。

圖2 不同溫度下ASJS水解度結果Fig.2 Results of hydrolysis degrees of ASJS under different temperatures

2.2.2 不同酶添加量下ASJS水解度結果 由圖3可以看出,當PAP酶添加量由0.5%增加到3%時,水解度隨著酶添加量增加逐漸增加,當酶添加量由3%到5%時,水解度增加很小。考慮到較高的酶添加量會提高綜合加工成本,故確定對PAP的酶添加量繼續在3%左右進行考察。

圖3 不同酶添加量下ASJS水解度結果Fig.3 Results of hydrolysis degrees of ASJS by different enzyme dosages

PRO與FLA水解度均是隨酶添加量增加而升高,而當酶添加量由3.0%到5.0%時,水解度增加變緩,綜合考慮降低成本的需要,故選擇PRO與FLA酶添加量均為3.0%左右進行進一步優化。

2.2.3 不同反應時間下ASJS水解度結果 由圖4可知,在5 h內PAP水解度隨著反應時間增加而逐漸升高,在5～9 h時,水解度升高趨勢變的較緩慢,考慮到長時間水解會增加生產成本和造成微生物滋生,故選擇對PAP的反應時間考察圍繞5 h的時間點展開。

圖4 不同反應時間下ASJS水解度結果Fig.4 Results of hydrolysis degrees of ASJS under different time

不同反應時間對PRO與FLA的水解度作用趨勢基本相同,均是在5 h以內水解度隨著反應時間增加而逐漸升高,而在5 h之后增加程度減緩,故確定PRO與FLA的反應時間也在5 h左右進行優化。

2.3 ASJS正交實驗優化結果

2.3.1 PAP正交實驗結果 在單因素實驗結果之上,對溫度、酶添加量和反應時間這3個因素進行進一步考察優化,實驗結果和顯著性分析結果如表3、表4所示。

由正交實驗表直觀分析可得出A3B2C1組合較好,對PAP水解度的影響三種因素主次順序為:酶添加量>溫度>反應時間,即酶添加量對實驗的影響最大,溫度次之,反應時間最小。由表4可得出酶添加量對水解度具有顯著影響,溫度和反應時間兩個因素的影響均不顯著。相關研究指出在正交實驗中應嚴格控制具有顯著影響的因素,而對于不顯著因素,通常根據實際生產中操作性及經濟成本等具體情況選擇優水平[20]。經綜合考慮后選擇反應時間較短且水解度與A3B2C1相差很小的A2B2C3組合為最優組合,ASJS的PAP酶解優化工藝條件為:溫度70 ℃、酶添加量3.0%、反應時間4 h。在此條件下進行實驗,測得水解度為32.14%。

表3 PAP酶解正交實驗

表4 PAP酶解顯著性分析結果

注：顯著性差異用*標注;置信水平為0.95，表6、表8同。2.3.2 PRO正交實驗結果 在單因素實驗結果之上,采用正交實驗設計對溫度、酶添加量和反應時間這3個因素進行進一步考察優化,實驗結果和顯著性分析如表5、表6所示。

由正交實驗表直觀分析可得出A1B2C1組合較好,對PRO水解度產生影響的三種因素主次順序為酶添加量>溫度>反應時間,即酶添加量對實驗的影響最大,溫度次之,反應時間最小。由表6可得出酶添加量和溫度對水解度具有顯著影響,而反應時間的影響不顯著。經綜合考慮后選擇較短反應時間的A1B2C3組合為最優組合,ASJS的PRO最優酶解工藝條件為:溫度45 ℃、酶添加量3.0%、反應時間4 h。在此條件下進行驗證實驗,實際測得水解度為31.09%。

表5 PRO酶解正交實驗

表6 PRO顯著性分析表

2.3.3 FLA正交實驗結果 在單因素實驗結果基礎上,進一步對溫度、酶添加量和反應時間這3個因素進行優化,相關實驗結果和顯著性分析如表7、表8所示。

由正交實驗表直觀分析得出A1B2C1組合較好,對FLA水解度產生影響的三種因素的主次順序為溫度>反應時間>酶添加量,即溫度對實驗的影響最大,反應時間次之,酶添加量最小。由表8可得出溫度對水解度具有顯著影響,而酶添加量和反應時間的影響均不顯著。經綜合考慮后選擇較少酶添加量和較短反應時間的A1B3C3組合為最優組合,ASJS的FLA酶解最優工藝條件為:溫度45 ℃、酶添加量2.0%、反應時間4 h。在此條件下進行實驗,測得水解度為11.89%。

表7 FLA正交實驗設計

表8 FLA顯著性分析表

2.4 多酶復配的比較實驗結果

ASJS的雙酶與三酶的水解比較實驗結果如表9所示。三酶復配使用的水解度比雙酶、單PAP及單PRO最佳條件下均低,說明多肽的得率降低了。推測在水解反應后期可能出現了過度水解現象,即水解液中蛋白質及多肽繼續被分解成小分子肽及氨基酸,由于雙縮脲法只能檢測到蛋白質及多肽的原因從而出現這種現象[19]。

表9 多酶復配水解能力比較

圖5 酶解液清除羥自由基作用Fig.5 Enzymolysis liquid scavenging hydroxyl free radicals注：圖中蛋白酶分別為:1：PAP,2：PRO,3：FLA, 4：PAP與PRO,5：PAP與FLA,6：PRO與FLA, 7：PAP與PRO,再加FLA,8：卵PAP,9：體壁PAP，圖6同。

2.5 清除羥自由基能力測定結果

由圖5可以看出,各組分濃度在10 mg/mL時清除羥自由基能力均顯著高于5 mg/mL(p<0.01)。在這兩種樣品濃度下,各組分間清除能力強弱趨勢比較一致,在ASJS的三種單酶水解產物中,PAP好于PRO及FLA。雙酶及三酶復配水解產物中,PAP與FLA復配水解產物好于另外三種復配方式,但顯著低于PAP(p<0.05)。另外做為對照的刺參卵PAP水解產物和仿刺參體壁PAP水解產物均顯著低于7種ASJS水解產物,且存在極顯著差異(p<0.01)。綜合比較,ASJS的PAP水解產物的清除羥自由基能力在9種不同的水解產物中最好。

2.6 清除超氧陰離子自由基測定結果

圖6 酶解液清除超氧陰離子作用Fig.6 Enzymolysis liquid scavenging superoxide anion free radicals

由圖6可以看出,各組分濃度在10 mg/mL時清除超氧陰離子能力均顯著高于5 mg/mL(p<0.01)。在此兩種樣品濃度下,各組分間清除能力強弱比較趨勢相同,在ASJS的三種單酶水解產物中,PAP好于PRO及FLA。雙酶及三酶復配水解產物中,三酶水解產物好于另外三種雙酶復配水解方式,略低于PAP,但無顯著差異(p>0.05)。另外做為對照的刺參卵PAP水解產物和仿刺參體壁PAP水解產物均顯著低于ASJS木瓜水解產物(p<0.01)。綜合比較,ASJS的PAP水解產物清除超氧陰離子自由基能力在9種不同的水解產物中最好。

3 結論

本實驗以雙縮脲法結合三氯乙酸法測定水解度,通過單因素與正交實驗,確定了三種蛋白酶的最佳酶解工藝條件,即PAP酶添加量3.0%、溫度70 ℃及反應時間4 h;PRO酶添加量3.0%、溫度45 ℃及反應時間4 h;FLA酶添加量2.0%、溫度45 ℃及反應時間4 h。PAP與PRO表現出較強的水解能力,在優化后的條件下PAP水解度為32.14%,PRO為31.09%,FLA為11.89%。通過與雙酶與三酶的水解實驗比較得出,ASJS的單PAP及單PRO水解度較高。

體外抗氧化實驗結果表明,各組在10 mg/mL時清除羥自由基和超氧陰離子自由基能力均顯著高于5 mg/mL。ASJS的PAP產物好于PRO、FLA、三種雙酶及三酶復配水解產物,同時好于仿刺參卵和體壁兩種PAP水解產物。綜合比較,ASJS的PAP水解產物的體外抗氧化活性在9種水解產物中最好,可以作為進一步制備抗氧化活性物質的材料。

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Optimization of enzymolysis technology ofApostichopusjaponicusspermary and antioxidant activitiesinvitroof hydrolysates

ZHANG Jian1,2,3,LIU Shao-wei1,*,ZHANG Yi2,WANG Gong-ming3,ZHAO Yun-ping3,LIU Jing-xi3,JING Yue-xin3,LIU Fang3

(1.College of Biotechnology,The State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;2.Shanghai Institutes for Biological Sciences,Chinese Academy of Science,Shanghai 200233,China;3. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute,Yantai 264006,China)

Apostichopusjaponicusspermary(ASJS)was used as material to optimize enzymolysis technology according to the degree of hydrolysis,and antioxidant activities of hydrolysates were also investigated. The hydrolysis enzymes included PAP,PRO and FLA. The biuret method combined with TCA was used to determine degree of hydrolysis. Through single factor test and orthogonal test,the optimized conditions of each enzyme were obtained. And at the same time,the enzymolysis test used sole enzyme compared with two enzymes and three enzymes was carried out. Finally,antioxidant activities of different hydrolysates were determinedinvitro. The results showed that the optimum conditions of enzymolysis technology with sole enzyme were as follows:PAP with the enzyme dosage 3.0%,temperature 70 ℃ and enzymolysis time 4 h,PRO with the enzyme dosage 3.0%,temperature 45 ℃ and enzymolysis time 4 h,FLA with the enzyme dosage 2.0%,temperature 45 ℃ and enzymolysis time 4 h. Under the optimum condition hydrolysis degrees of hydrolysis of PAP,PRO and FLA were 32.14%,31.09% and 11.89%,respectively. The enzymolysis degrees of double enzyme and three enzymes were lower than sole PAP and PRO. The results of scavenging abilities of hydroxyl radical and superoxide anion radicals displayed that with concentrations of 5 mg/mL and 10 mg/mL,the hydrolysate of ASJS hydrolyzed by PAP owned better ability than hydrolysates produced through PRO and FLA,double enzymes,three enzymes,and those from spawn and body wall hydrolyzed by PAP. In conclusion,PAP hydrolysate from ASJS exhibited good antioxidant activities,and it is promising to be utilized and exploited.

Apostichopusjaponicusspermary;enzymolysis;optimization;antioxidant activities

2016-08-17

張健(1980-)，男，博士，副研究員，研究方向：生物化學與分子生物學，食品科學與工程，E-mail：zjsd408@163.com。

*通訊作者:劉少偉(1972-)，男，博士，教授，研究方向：生物化學與分子生物學，食品科學與工程，E-mail：swliu@ecust.edu.cn。

山東省現代農業產業技術體系刺參產業創新團隊建設項目(SDAIT-22-07)；煙臺市科技發展計劃項目(2014ZH081)。

TS254.1

B

1002-0306(2017)05-0232-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.036