石榴渣多酚提取及抗氧化活性研究

趙光遠(yuǎn),許艷華,陳美麗,縱 偉,*

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450002;2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450002)

石榴渣多酚提取及抗氧化活性研究

趙光遠(yuǎn)1,2,許艷華1,2,陳美麗1,2,縱 偉1,2,*

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450002;2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450002)

以石榴渣為實(shí)驗(yàn)原料,優(yōu)化石榴渣多酚提取的工藝,并研究它的抗氧化性質(zhì)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology,RSM)中的中心組合設(shè)計(jì)對(duì)石榴渣多酚的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。用傳統(tǒng)的溶劑提取法提取石榴渣中的多酚類物質(zhì),并利用福林酚法測(cè)定其含量。其抗氧化性用DPPH自由基清除能力和還原能力來評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,最佳的石榴渣提取工藝條件是:41%的乙醇作溶劑,液料比20 mL/g,在62 ℃下提取3.5 h時(shí)多酚的得率最大為4.88 mg GAE/g,與預(yù)測(cè)值 5.034 mg GAE/g接近。石榴渣多酚有較強(qiáng)的DPPH自由基清除率,且總抗氧化性與提取的石榴渣多酚濃度呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.9988。

石榴渣，響應(yīng)面法，多酚，抗氧化

活性氧,如過氧化氫、超氧陰離子、羥基自由基等是身體內(nèi)基礎(chǔ)生理代謝過程中產(chǎn)生的[1]。雖然正常的細(xì)胞活動(dòng)需要活性氧的參與,但過多的活性氧會(huì)破壞所有類型大分子的結(jié)構(gòu),包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、核酸和脂肪?？寡趸瘎┛梢砸种蒲趸^程,防止體內(nèi)自由基的形成[2],已發(fā)現(xiàn)多酚可以作為抗氧化劑來抵抗有自由基誘導(dǎo)的疾病[3-4]。因此,抗氧化劑在維持身體健康和預(yù)防疾病方面越來越受到關(guān)注。

石榴(PunicagranntumL.)是一種古老、獨(dú)特而神秘的水果,主要種植在亞洲、北非和中東部分地區(qū)[5-6]。石榴一般用于直接食用,或加工成飲料飲用,已報(bào)道石榴具有抗病毒和抗癌的作用[7]。石榴渣作為石榴汁生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物,其含有大量的抗炎癥成分、抗氧化物、維生素E、甾醇類物質(zhì)和石榴酸[8-12]。然而,在過去的幾年研究里,人們主要側(cè)重于對(duì)石榴皮的研究,所以本文采用響應(yīng)面分析法對(duì)石榴渣多酚的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,得到的多酚得率最大為4.88 mg GAE/g,以期為石榴的綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴 當(dāng)?shù)氐某?石榴要求外觀完整,無破裂,八成熟。石榴剝皮后放入原汁機(jī)中榨汁,將石榴渣(包含石榴籽)放入真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h(真空度為:1 pa,溫度為:-65 ℃),分水含量約為1%,最后石榴渣狀態(tài)為無明顯可見的大顆粒即可。福林酚(Folin-Ciocalteu)(純度為99%)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(純度大于98%) 美國Sigma公司,其他試劑均為分析純。

XY-FD-18真空冷凍干燥機(jī) 上海欣諭儀器有限公司;SHA-C水浴恒溫振蕩器 金壇市中大儀器廠;752紫外可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限責(zé)任公司;HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中掛科學(xué)儀器有限公司;SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞萊生化儀器廠;J2Y-13.3E原汁機(jī) 中山市金正生活電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石榴渣中酚類物質(zhì)的提取方法 稱取4 g的石榴渣加入一定濃度(40%、70%、100%)的乙醇溶劑,在不同溫度(25、45、65 ℃)下水浴震蕩提取不同時(shí)間(0.5、2、3.5 h)后進(jìn)行抽濾,然后定容到100 mL,備用。

1.2.2 酚類物質(zhì)含量的測(cè)定 酚類物質(zhì)含量的測(cè)定采用福林-酚比色法:移液槍吸取0.3 mL的提取液與25 mL的比色管中,加蒸餾水至10 mL,接著加入0.5 mL的福林酚試劑后,振蕩5 min,再加入5%的碳酸鈉溶液5 mL,加入蒸餾水至反應(yīng)體系25 mL,搖勻,室溫下靜置90 min,在750 nm波長下測(cè)定吸光度。同時(shí)用蒸餾水作空白對(duì)照,每個(gè)樣品重復(fù)三次。采用沒食子酸為對(duì)照品,根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線算出石榴渣中提取液多酚的含量,以沒食子酸當(dāng)量表示,單位為:mg/g。

Y(mg/g)=C×V/M

式中:C為提取液多酚質(zhì)量體積分?jǐn)?shù),mg/mL;V為提取液定容后體積,mL;M為石榴渣質(zhì)量(g)。

1.2.3 石榴渣提取物的制備 準(zhǔn)確稱取10 g的石榴渣于燒瓶中,加入200 mL 42%的乙醇溶液,在62 ℃下水浴3.5 h,然后用真空泵進(jìn)行抽濾處理,收集到的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去多余的乙醇,最后用真空冷凍干燥機(jī)干燥至恒重,得到的石榴渣提取物進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 石榴渣多酚抗氧化性測(cè)定

1.2.4.1 石榴渣酚類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除能力測(cè)定 準(zhǔn)確量取2 mL的樣液,加入2 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液,混合均勻,黑暗處反應(yīng)30 min,以無水乙醇調(diào)零,測(cè)定其在517 nm處的吸光度值A(chǔ)i;同時(shí)測(cè)定2 mL樣品溶液與2 mL無水乙醇混合液在517 nm處的吸光度值A(chǔ)c;再測(cè)定2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合液在517 nm處的吸光度值A(chǔ)j。同一測(cè)定重復(fù)操作三次。計(jì)算清除率E[13]。

E(%)=[1-(Ai-Ac)/Aj]×100

1.2.4.2 還原能力的測(cè)定 量取0.5 mL的樣液于具塞試管中,加入0.2 mol/L,pH為6.6的磷酸緩沖液(將2.6865 g的Na2HPO4和1.9506 g的NaH2PO4溶解定容于100 mL的容量瓶中)2.5 mL和2.5 mL 1%的K3[Fe(CN)6],置于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min,然后迅速冷卻至室溫,加入2.5 mL10%的三氯乙酸(trichloroacetonitrile,TCA)溶液,于3000 r/min下離心10 min后取上清液2.5 mL,并加入2.5 mL的蒸餾水及0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,混合均勻,10 min后于700 nm下測(cè)定吸光度值,同時(shí)作空白管調(diào)零。同一測(cè)定重復(fù)操作三次[14-15]。吸光度值越大表示還原能力越強(qiáng)。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 響應(yīng)面法是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過程、描述自變量和因變量之間關(guān)系的有效方法[16]。選擇時(shí)間、溫度、溶劑濃度和料液比四個(gè)因素,以提取率為響應(yīng)值,通過中心組合設(shè)計(jì)法(Central Composite Design,CCD)來優(yōu)化提取的最佳條件。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 利用Design Expert 7.0分析軟件及Excel程序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCD相應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化石榴渣多酚提取工藝

根據(jù)CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)步驟進(jìn)行多酚的提取,如表1所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Design Expert進(jìn)行分析。

表1 石榴渣多酚提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.1.1 石榴渣多酚提取工藝優(yōu)化 根據(jù)CCD實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行回歸分析,得多元二次回歸方程:

Y=2.82+0.35A+0.60B-0.84C+0.45D+0.15AB+0.047AC+0.084AD-0.081BC+0.079BD-0.29CD+0.63A2-0.54B2-0.61C2-0.17D2

根據(jù)表2統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出,該模型在p<0.01水平上極顯著,失擬項(xiàng)0.1415不顯著(p>0.05)說明該模型可以用于石榴渣多酚提取的優(yōu)化分析,相關(guān)系數(shù)R2=0.9763,校正系數(shù)R2=0.9541,說明該模型擬合度較高,可以用于預(yù)測(cè)石榴渣多酚的優(yōu)化,因素A,B,C,D,CD,A2,B2,C2影響顯著(p<0.01),AB影響顯著(p<0.05),AC,AD,BC,BD不顯著,剔除不顯著項(xiàng),得到的多元回歸方程為:

Y=-3.58101-1.28536A+0.14400B+0.085937C+0.18370D+5.10417×10-3AB-1.27500×10-3CD+0.27984A2-1.35088×10-3B2-6.72612×10-4C2-2.93957×10-3D2

表2 二次回歸的方差分析

從圖1響應(yīng)面圖可以看出各因素的交互作用對(duì)石榴渣多酚得率的影響,利用Design Expert軟件對(duì)多元二次方差模型進(jìn)行提取條件優(yōu)化,得出石榴渣的最佳提取優(yōu)化條件為:41.59%的乙醇作溶劑,液料比20 mL/g,在61.80 ℃下提取3.5 h時(shí)多酚的得率最大為5.03 mg GAE/g。

進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí),為了便于操作,優(yōu)化條件修改為乙醇濃度41%、液料比20 mL/g、提取溫度62 ℃、提取時(shí)間3.5 h,多酚得率可達(dá)4.88 mgGAE/g,為預(yù)測(cè)值的97.02%,與預(yù)測(cè)值符合度較高,因此此實(shí)驗(yàn)條件可以用于石榴渣多酚提取的優(yōu)化。

2.1.2 多酚含量與DPPH自由基清除能力的關(guān)系 多酚含量與DPPH自由基的清除率二者之間的相互關(guān)系如圖2所示,石榴渣多酚含量與DPPH自由基清除能力大小相關(guān)性顯著,且相關(guān)系數(shù)為0.9494,說明石榴渣多酚在抗氧化中起了重要作用。多酚濃度與還原能力二者之間的相互關(guān)系如圖3所示,石榴渣多酚的得率與還原能力呈線性關(guān)系,且其相關(guān)系數(shù)為0.9988。

圖2 提取物的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging activity of the extract

圖3 石榴渣提取物的還原能力Fig.3 Reducing power of the extract from the pomegranate slag

3 討論與結(jié)論

在先前的研究中,利用較少的參數(shù)進(jìn)行提取優(yōu)化,在不同的實(shí)驗(yàn)中對(duì)液固比、提取時(shí)間、溫度和乙醇濃度進(jìn)行了研究[17]。響應(yīng)面法是包括液固比、提取時(shí)間、溫度和乙醇濃度的一個(gè)全面的實(shí)驗(yàn)方法,在優(yōu)化許多因素時(shí),響應(yīng)面法是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過程的有效工具,RSM考慮交互作用,并在合理的范圍內(nèi)優(yōu)化參數(shù),利用更少的重復(fù)和所需的總時(shí)間來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[18-19]。

從三維響應(yīng)面圖,如圖1所示,我們可以更好地理解變量之間的相互關(guān)系。在本研究中,可以發(fā)現(xiàn)四個(gè)因素都是顯著的。

為評(píng)估石榴渣的抗氧化性,本研究利用DPPH自由基清除能力和還原能力兩種實(shí)驗(yàn),這眾多測(cè)定抗氧化方法中被普遍接受的兩種評(píng)價(jià)方法。

石榴渣多酚的提取條件可以通過響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)表明最佳的石榴渣提取工藝條件是:41%的乙醇作溶劑,液料比20 mL/g,在62 ℃下提取3.5 h時(shí)多酚的得率最大為4.88 mg GAE/g。并且有很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力和還原能力。因此,在醫(yī)藥和食品行業(yè)使用石榴渣提取物必定有很大的前景。

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Extraction and antioxidant activity of polyphenols from pomegranate slag

ZHAO Guang-yuan1,2,XU Yan-hua1,2,CHEN Mei-li1,2,ZONG Wei1,2，*

(1.College of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China;2.Collaborative Innovation Center of Food Production and Safety,Henan Province,Zhengzhou 450002,China)

To optimize the extraction of polyphenols from pomegranate seed and research its antioxidant activity.Methods:By traditional solvent extration method obtained the polyphenols in pomegranate seed,then determined by Folin-Ciocalteu(FC)method.The levels of the four variables were optimized using response surface methodology(RSM)with central composite design.The antioxidant activity was determined by 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)free radical scavenging ability and the assays of deoxidization capability.Results:The optimal conditions were determined as follows:extraction time of 3.5 h,extraction temperature of 62 ℃,ethanol concentration of 41%,and liquid-solid of 20 mL/g.Under these condition,the extraction value of polyphenols was 4.88 mg GAE/g material,which is accordance with the predicted value 5.034 mg GAE/g material.There is a positive correlation between polyphenols concentration from pomegranate seeds and DPPH free radical scavenging,and the correlation coefficient is 0.9988.

pomegranate slag;response surface methodology;phenolics;antioxidant

2016-09-13

趙光遠(yuǎn)(1973-),男，博士，教授，主要從事果蔬深加工方向，E-mail:guangyuan-zhao@163.com。

*通訊作者:縱偉(1965-),男，博士，教授，主要從事果蔬深加工方向，E-mail:zongwei1965@126.com。

河南省食品加工過程安全控制技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(C20150024);果蔬加工高新技術(shù)(16IRTSHN010)；2015年徐州市高層次創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才引進(jìn)計(jì)劃(2015)035號(hào)。

TS255.1

B

1002-0306(2017)05-0228-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.035