抗原致敏DC與CIK共培養體外抗小細胞肺癌的研究

楊佳，馮陽春，黃艷春

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 檢驗科，新疆 烏魯木齊 830011)

·論 著·

抗原致敏DC與CIK共培養體外抗小細胞肺癌的研究

楊佳，馮陽春，黃艷春

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 檢驗科，新疆 烏魯木齊 830011)

目的：觀察小細胞肺癌NCI- H209細胞株抗原致敏樹突細胞(DC)與同源細胞因子誘導殺傷(CIK)細胞共培養后的DC- CIK細胞體外對小細胞肺癌NCI- H209的殺傷活性，為小細胞肺癌的特異性細胞免疫治療提供實驗依據。方法：將健康成人外周血單個核細胞來源的DC經NCI- H209細胞株抗原致敏后與同源CIK細胞共培養，實驗分3組：NCI- H209抗原致敏DC與CIK共培養組(A組)、未致敏DC與CIK共培養組(B組)和單純CIK組(C組)。流式細胞儀檢測DC及CIK免疫表型,使用CCK- 8法檢測3組效應細胞對NCI- H209細胞的殺傷活性。結果：體外誘導培養出的抗原致敏DC和未致敏DC經流式檢測，均高表達CD80、CD86、CD11c。CIK細胞隨著培養天數的延長主要效應細胞CD3+CD8+、CD3+CD56+表達持續升高，至第14天流式檢測結果示：A組和B組CD3+CD8+表型分別為71.8%和65.2%,C組CD3+CD56+達到31.1%。CCK- 8法檢測結果發現，相同效靶比下A組對NCI- H209細胞株的殺傷活性明顯高于B、C組，且隨著效靶比增加,其殺傷效應亦顯著增加。效靶比為5∶1時A組殺傷率為(68.82±2.55)%，B組殺傷率為(56.64±2.06)%，C組殺傷率為(55.98±2.63)%(P=0.007)；效靶比為10∶1時A組殺傷率為(74.06±2.64)%，B組殺傷率為(60.11±2.74)%，C組殺傷率為(58.34±1.88)%(P=0.005)；效靶比為20∶1時A組殺傷率為(79.17±3.51)%，B組殺傷率為(65.33±2.48)%，C組殺傷率為(60.47±2.85)%,(P=0.001)。結論：用NCI- H209細胞裂解物分離的混合蛋白致敏DC可以提高CIK細胞殺傷NCI- H209細胞效應,為小細胞肺癌的綜合治療提供新的策略。

小細胞肺癌； 樹突狀細胞- 細胞因子誘導殺傷細胞； 過繼性細胞免疫治療

小細胞肺癌是人類常見的惡性實體瘤之一，多數患者確診時已發生轉移，中位總生存期僅8～11個月，5年生存率不足5%[1- 3]。雖然一線化療后可得暫時緩解，但大多數患者短期內出現復發，復發后放、化療效果均不理想。傳統的治療手段并未使患者獲得進一步的生存受益，小細胞肺癌的治療已處于瓶頸，迫切需要新的治療策略來提高療效[4- 5]。

近幾年來，過繼性細胞免疫治療日益受到關注且發展前景廣為業界看好，特別是特異性細胞免疫治療因其強大的抗腫瘤作用和明顯的療效已成為國際研究的熱點，但目前針對小細胞肺癌的特異性細胞免疫治療尚未見報道。由于絕大多數小細胞肺癌患者因沒有手術機會而無法得到大量自身腫瘤組織作為抗原，因此，本研究嘗試采用小細胞肺癌株NCI- H209細胞裂解物作為抗原致敏樹突細胞(DC)，再與同源細胞因子誘導殺傷(CIK)細胞共培養，通過體外實驗證實致敏后的DC- CIK細胞對小細胞肺癌的殺傷作用，為小細胞肺癌特異性細胞免疫治療提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 材料

X- VIVO15無血清培養基購自LONZA公司，重組人細胞因子(rhGM- CSF、rhIL- 4、rhTNF- α、rhIL- 1α)購自Peprotech公司，胎牛血清購自美國Hyclon公司，rhIL-2購自北京四環生物制藥有限公司，anti- CD3McAb購自德國miltenyiBiotec公司，IFN- γ購自上海凱茂生物醫藥有限公司，人外周血淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限公司，鼠抗人CD3- FITC、CD8- PE、CD56- PE、CD80- PE、CD86- FITC、CD- 11c- FITC均購自美國Beckman公司，CCK- 8試劑盒購自日本同仁化學研究所，外周血單個核細胞(PBMC)分離自健康志愿者外周血，NCI- H209細胞株和A549細胞株源自美國ATCC。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將效應細胞分為3組：A組為NCI- H209細胞裂解物分離的混合蛋白致敏的DC與CIK細胞共培養，B組為未經致敏的DC與CIK細胞共培養，C組為單純CIK。

1.2.2 NCI- H209細胞裂解物分離的混合蛋白抗原的制備 參考劉暢等[6]提取抗原的方法，將小細胞肺癌NCI- H209細胞株在含10%胎牛血清的RPMI- 1640中常規培養傳代，消化收集1×107個NCI- H209細胞，生理鹽水洗滌2遍，加入1 ml單純RPMI- 1640放入液氮中，10 min后迅速取出放入37 ℃水浴中，待其完全融化后再次放入液氮中，反復3次。離心除去細胞碎片，微孔濾膜過濾，收集濾液于4 ℃保存備用。

1.2.3 DC的誘導培養 取健康成人外周血30 ml經淋巴細胞分離液密度梯度分離得到PBMC，用X- VIVO15無血清培養基重懸細胞并平均分至2個25 cm2培養瓶中，37 ℃、5%CO2培養箱靜置4 h后收集非貼壁細胞(用于CIK細胞培養)，貼壁細胞加入含rhGM- CSF 1×106U·L-1、rhIL- 45×105U·L-1的X- VIVO15無血清培養基。隔天半量換液、補充細胞因子，第7天每瓶加入rhTNF- α 100 μg·L-1(2×106U·L-1)，倒置相差顯微鏡及電鏡觀察細胞的形態。

1.2.4 CIK細胞的培養擴增 收集步驟1的非貼壁細胞，調整密度為(3～5)×106ml-1，懸于含IFN- γ 1 000 U·ml-1的X- VIVO15無血清培養基中，放置37 ℃、5% CO2培養箱中培養。第2天加入細胞因子rhIL- 1α 1 ng·ml-1、anti- CD3McAb 100 ng·ml-1和rhIL- 2 1 000 U·ml-1。根據細胞生長情況適時補充培養基。

1.2.5 小細胞肺癌抗原致敏DC DC誘導培養的第6天加入腫瘤凍融抗原100 μl，混勻，繼續于37 ℃、5%CO2培養箱培養，第7天常規加入rhTNF- α 2×106U·L-1，第8天收獲成熟的DC。

1.2.6 DC與CIK細胞共培養 培養第8天，收集NCI- H209細胞凍融抗原致敏過的DC、未致敏的DC、CIK，分別計數，按DC∶CIK=1∶50～100比例將DC按實驗分組分別與CIK細胞混合共培養，培養液為含rhIL- 2 1 000U·ml-1的X-VIVO15無血清培養基，觀察DC與CIK細胞共培養后的增殖情況。

1.2.7 免疫表型的檢測 流式細胞儀檢測DC(第0、8天)的免疫表型CD80、CD86、及CD11c。檢測CIK細胞(第0、14天)的免疫表型CD3、CD4、CD8、CD56。步驟：收獲DC及CIK細胞，PBS洗滌重懸，調密度為2×109L-1，取細胞懸液50μl加入Ep管內，加入FITC標記的上述鼠抗人單抗，混勻，4 ℃避光孵育30min，PBS洗滌2次，PBS重懸，流式細胞術檢測，分析軟件為Cellquse。

1.2.8 殺傷活性的檢測 以CCK- 8比色法檢測3組不同的效應細胞對靶細胞的殺傷活性，靶細胞分別為NCI-H209細胞(小細胞肺癌細胞)、A549細胞(肺腺癌細胞)。將靶細胞濃度調整至5×105個·ml-1后接種于96孔培養板中，每孔加入靶細胞100μl(5×104個細胞·孔-1)，實驗孔按效靶比分別為5∶1、10∶1、20 ∶1加入效應細胞，同時設效應細胞對照孔，相同條件設5個復孔，37 ℃、5%CO2條件下混合培養24h，然后向每孔加入10μlCCK- 8溶液，將培養板在培養箱內孵育4h，酶標儀在450nm波長下讀取各孔吸光度值。殺傷活性(%)=[1- (實驗孔OD值- 效應細胞對照組OD值)/靶細胞對照組OD值]×100%

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 細胞形態觀察

DC：從外周血分離的PBMC在培養瓶中靜置4 h 后鏡下見貼壁細胞為體積較小的單個圓形細胞，經rhGM- CSF、rhIL- 4誘導后可見部分細胞體積不斷增大，且形態不規則。第7天加入rhTNF- α誘導成熟后大部分細胞半懸浮，表面出現樹突狀突起，呈典型DC形態。致敏DC和未致敏DC經流式細胞術檢測，結果顯示均高表達CD80、DC86、CD11c。見表1、圖1。

表1 第8天兩組DC流式細胞術檢測結果 %

圖1 Ag- DC高表達CD80、CD86、CD11c

CIK細胞：未貼壁PBMC經IFN- γ、anti- CD3 McAb、IL- 1α、rhIL- 2誘導至第3天細胞開始聚集成團，細胞體積增大、形態不規則、胞體透亮，似葡萄串，隨著細胞培養天數的延長細胞數量急劇增加，細胞團越來越大，主要效應細胞CD3+CD8+、CD3+CD56+表達持續升高，至第14天3組細胞數量均超過3×109個，臺盼藍染色檢測細胞活率都在98%以上。流式細胞術檢測結果示：A組和B組CD3+CD8+表型分別為71.8%和65.2%，C組CD3+CD56+達到31.1%。見表2，圖2、3。

表2 第14天各組細胞流式細胞術檢測結果 %

圖2 Ag- DC- CIK高表達CD3+CD8+

圖3 CIK高表達CD3+CD56+

2.2 對NCI- H209細胞殺傷活力的體外測定

3組效應細胞都在培養至第14天時進行了對NCI- H209細胞殺傷作用的檢測，另外作為對照的A組還對A549細胞進行殺傷作用檢測。結果顯示，各組效應細胞都隨著效靶比的增高殺傷力增強，A組效應細胞在不同效靶比時較B組和C組效應細胞都具有較強的殺傷能力，B組效應細胞在效靶比達到20∶1時殺傷作用較CIK細胞明顯增強(65.33±2.48vs60.47±2.85,P<0.05)，差異具有統計學意義。當抗原致敏DC- CIK效應細胞殺傷A549細胞時，殺傷作用一般，僅效靶比達到20∶1時作用較C組明顯增強，與B組表現出相似的殺傷作用。見表3。

表3 各組細胞殺傷活性比較%

a 與CIKvsNCI- H209組比，P<0.05; b 與DC- CIKvsNCI- H209組比，P<0.05

3 結 論

近年來腫瘤免疫治療取得顯著的進步，其中對DC瘤苗和CIK細胞的研究最為常見。DC作為機體內專職的抗原提呈細胞,在攝取、提呈抗原及激發后續特異性抗腫瘤免疫反應中發揮著不可替代的作用。在DC處理提呈抗原過程中,其表面分子CD80、CD86、HLA- DR的表達水平又起到重要的制約作用,直接關系到DC免疫激發的功能狀態。其中CD80、CD86作為DC激活T淋巴細胞過程中的重要共刺激分子作用尤為重要,其表達水平標志著DC免疫激活能力的高低[7- 8]。

CIK細胞主要通過NKG2D受體途徑發揮溶解細胞效應，清除腫瘤患者殘存的腫瘤細胞或腫瘤微病灶，可有效防止復發，是治療晚期惡性腫瘤又一重要選擇[9- 12]。DC負載自體腫瘤抗原后可誘導產生特異性CIK細胞，發揮特異性抗腫瘤免疫效應，目前在治療腎癌、卵巢癌、肺腺癌等臨床試驗中均取得了較好的療效[13-15]。

負載特異性抗原的DC疫苗結合過繼細胞治療在科研和臨床的應用具有巨大的潛力和良好的效果，但是小細胞肺癌沒有區別于正常組織的腫瘤特異性蛋白作為腫瘤抗原，并且絕大多數小細胞肺癌患者因沒有手術機會而無法得到大量的自身腫瘤組織來制備全細胞腫瘤抗原。因此，本實驗采用小細胞肺癌株NCI- H209的細胞裂解物分離出的混合蛋白用來致敏DC，同時將抗原致敏的DC與同源的CIK細胞共培養，在體外的細胞毒性實驗中驗證致敏DC- CIK細胞對NCI- H209的特異性應答和殺傷NCI- H209能力。應用流式細胞儀測定免疫細胞表型的結果可以看出，隨著培養時間的增長具有殺傷活性的CD3+CD8+、CD3+CD56+免疫細胞明顯增加，且A組和B組的CD3+CD8+細胞占比較高，而C組CD3+CD56+免疫細胞占比較高，這可能與DC釋放IL- 2、IFN- γ、IL- 12等多種細胞因子促進了CD3+CD8+細胞的增殖有關。體外殺傷試驗結果在5∶1～20∶1的效靶比范圍內A、B、C3組效應細胞對NCI-H209均有殺傷作用，這種殺傷作用隨效靶比的增高而增強，而且A組殺傷率高于B、C組，證實用NCI-H209細胞裂解物分離的混合蛋白致敏DC可以提高CIK細胞的殺瘤效應。

本研究初步探索了一種更為有效的治療小細胞肺癌的體細胞免疫治療方法，所獲得的抗原致敏DC-CIK細胞具有較強的抗腫瘤特異性和殺傷作用，為小細胞肺癌的綜合治療提供了新的策略。

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(本文編輯：周蘭波)

Study on the co- culture of DC and CIKinvitroagainst small cell lung cancer

YANG Jia，FENG Yang- chun，HUANG Yan- chun

(DepartmentofClinicalLaboratory，theAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011,China)

Objective: To observe the dendritic cells(DC)- homologous cytokine induced killer(CIK) cellsinvitrokilling activity of small cell lung cancer NCI- H209 after the co- culture of the sensitized DC by the small cell lung cancer NCI- H209 cells antigen and CIK cells, provide the experimental basis for the treatment of small cell lung cancer of specific cellular immunity. Methods: The DC cells from healthy adult human peripheral blood mononuclear cells were sensitized by NCI- H209 cell line and co- cultured with CIK cells, the effector cells were divided into three groups: the sensitized DC by NCI- H209 antigen and CIK cells co- culture group(group A), the unsensitized DC and CIK cells co- culture group(group B), simple CIK group(group C). DC and CIK cells were detected by flow cytometry, and the cytotoxicity of three groups of effector cells to NCI- H209 cells was detected by CCK- 8 assay. Results:Invitroculture of antigen- sensitized DC and unsensitized DC were detected by flow cytometry, high expressions of CD80, CD86, CD11c were found. CIK cells with prolongation of culture days, CD3+CD8+, CD3+CD56+expressions of the main effector cells remained elevated, on the 14th day flow detection showed that CD3+CD8+phenotypes in the group A and group B were 71.8% and 65.2%, CD3+CD56+in the group C was 31.1%. By CCK- 8 method, the results showed that group A was significantly higher than that of the group B and group C, and the killing effect of the group A was also significantly increased with the increase of the target ratio. When the effect target ratio was 5∶1,thekillingratewas(68.82±2.55)%inthegroupA, (56.64±2.06)%inthegroupB, (55.98±2.63)%inthegroupC(P=0.007); when the effect target ratio was 10∶1,thekillingratewas(74.06±2.64)%inthegroupA, (60.11±2.74)%inthegroupB, (58.34±1.88)%inthegroupC(P=0.005); when the effect target ratio was 20∶1,thekillingrateinthegroupAwas(79.17±3.51) %, (65.33±2.48)%inthegroupB, (60.47±2.85)%inthegroupC(P=0.001). Conclusion: The sensitized DC by NCI- H209 can improve the killing effect of CIK cells, and provide a new strategy for the comprehensive treatment of small cell lung cancer.

small cell lung caner； dendritic cells- cytokine induced killer cells； adoptive cellular immunotherapy

2016- 09- 19

2016- 12- 09

新疆醫科大學科研創新基金資助項目(No. XYDCX201485)

楊佳(1982-)，女，新疆烏魯木齊人，主治醫師，醫學碩士。E- mail:16558290@qq.com

黃艷春 E- mail:huangyanchun0619@sohu.com

楊佳,馮陽春,黃艷春.抗原致敏DC與CIK共培養體外抗小細胞肺癌的研究[J].東南大學學報:醫學版,2017,36(2):225- 229.

R- 33; R734.2

A

1671- 6264(2017)02- 0225- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.02.019