有機消泡劑對棘孢木霉菌株Tr148c液體發酵分生孢子產量的影響

馬曉梅,王 軍,2,曠文豐,褚 凱,陳 晨 ,毛偉力*

(1.上海萬力華生物科技有限公司，上海 201203；2.安徽農業大學，安徽 合肥 230036)

有機消泡劑對棘孢木霉菌株Tr148c液體發酵分生孢子產量的影響

馬曉梅1,王 軍1,2,曠文豐1,褚 凱1,陳 晨1,毛偉力1*

(1.上海萬力華生物科技有限公司，上海 201203；2.安徽農業大學，安徽 合肥 230036)

為了篩選對發酵液中棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株Tr148c的分生孢子產量無副作用的消泡劑，在PDA培養基中分別加入0.1%、0.4%和0.7%的10種消泡劑。其中天然油脂(豆油)、聚醚類(GPE-6330，GP-6301)和有機硅類(L-101a，L-104a)對菌株Tr148c的生長抑制率都顯著低于其它消泡劑(P≤0.05)。將篩選出的5種消泡劑進行消泡測試，發現GPE-6330、L-101a和L-104a在消泡和抑泡能力上都分別顯著優于豆油和GP-6301(P≤0.05)。考察了GPE-6330、L-101a和L-104a的用量及對菌株Tr148c產孢量的影響。在相同條件下，當L-101a對發酵液的消泡和抑泡效果達到生產工藝要求時，其用量以及對菌株Tr148c分生孢子產量的影響都顯著優于GPE-6330和L-104a(P≤0.05)。

木霉菌；有機消泡劑；液體發酵；消泡能力

木霉菌(Trichodermaspp.)是一種已廣泛應用于蔬菜、水果和花卉等多種經濟作物上的生防微生物，具有競爭、重寄生、抗生、誘導抗性和促進生長等多種功能，在作物病害生物防治中起到了重要作用[1-2]。木霉菌孢子制劑是目前應用在農業生產中的一種主要形式[3]。如何獲得大量的木霉菌孢子，是制備木霉菌孢子制劑的關鍵[4]。雖然深層液體發酵技術為木霉菌孢子產業化生產帶來了可能性，但在液體發酵過程中，由于通氣、攪拌、菌液黏稠度逐漸加大以及培養基中代謝產物積累等原因，發酵液會產生大量的泡沫[5]。當泡沫超過一定范圍時，極易造成發酵液漫罐、雜菌污染或必須降低裝料系數等不利影響[6]。張路軍等[7]采用有效的消泡劑，可使谷氨酸發酵生產設備利用率達90%。因此，對發酵過程中所產生的泡沫加以控制，是一項必要的技術措施。

目前液體發酵工業生產所采用的消泡方法有物理消泡法(如機械攪拌、靜電、冷凍、高速離心、加/減壓和超聲波[8])和化學消泡法。添加化學消泡劑經濟方便，而且消泡效果好，在液體發酵工業生產中得到了廣泛應用[9]。發酵工業常用的化學消泡劑有4類，分別是油脂、聚醚、有機硅和聚醚改性硅氧烷[10]。不同的化學消泡劑對微生物菌體生長的影響不同，它們可能會降低或抑制發酵微生物的生長和產量。李剛等[11]發現消泡劑磷酸三丁酯對光合細菌生長的抑制作用極為顯著。崔耀軍[5]發現消泡劑LB-625不僅對BAA中溫ɑ-淀粉酶發酵液體的消泡、抑泡作用明顯，而且對菌體生長無抑制作用，從而提高了發酵液的放罐體積和酶產量。

有機消泡劑已經廣泛應用于醫藥、造紙和農藥等多種行業的發酵生產中[12-15]。但有機消泡劑應用于棘孢木霉菌分生孢子發酵生產的報道還很少。作者通過比較多種消泡劑在發酵過程中對棘孢木霉菌株Tr148c生長的影響和對泡沫的控制能力，篩選出適合菌株Tr148c深層液體發酵生產分生孢子的消泡劑，擬為工業化生產木霉菌孢子制劑和穩定產品質量提供參考。

1 實驗

1.1 菌種、培養基及試劑

棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株Tr148c，由上海萬力華生物科技有限公司從采自安徽合肥的土壤樣品中篩選獲得，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No：5201)。

PDA培養基：在200 g去皮土豆中加入500 mL水，煮沸20 min，過濾，上清液中加葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，充分混勻，定容至1 L。分裝到1 L三角瓶中，裝液量500 mL，1×105Pa下滅菌20 min，冷卻至50 ℃，無菌條件下倒入培養皿，冷卻后備用。

發酵培養基：在200 g去皮土豆中加入適量的水，煮沸20 min，過濾，上清液中加甘露醇30 g·L-1、酵母粉1 g·L-1，充分溶解，定容至1 L。裝液量為150/500 mL[4]，1×105Pa下滅菌20 min，冷卻后備用。

消泡劑：豆油(天然油脂)，GPE-6330、GP-6301、GP-6303(聚醚類)，T-30c(高碳醇)，L-101a、L-104a、TSA-673(有機硅類)，LX-601、LX-603(聚醚改性聚硅氧烷類)，市售。

1.2 方法

1.2.1 斜面菌種培養

向250 mL茄瓶中加入80 mL PDA培養基，1×105Pa下滅菌20 min。斜面靜置冷卻后，在無菌條件下接種菌株Tr148c，并放入28 ℃培養箱中培養10 d，然后放置在4 ℃冰箱中保存備用[10]。

1.2.2 種子液的制備

在無菌條件下，刮取茄瓶中斜面生長的菌株Tr148c分生孢子，用無菌水配成5×107個·mL-1的分生孢子懸浮液(用血球計數法統計分生孢子數目)，即得種子液。

1.2.3 發酵液的制備

將150 mL發酵培養基加入到500 mL三角瓶中，1×105Pa下滅菌30 min，冷卻至室溫。按4%的接種量將種子液在無菌條件下轉接入三角瓶中，初始發酵液的孢子量為2×106個·mL-1，于轉速為200 r·min-1、28 ℃下發酵144 h[4]，即得發酵液。

1.2.4 消泡劑對菌株Tr148c生長抑制率的測定

分別將每種消泡劑按0.1%、0.4%、0.7%的用量添加到PDA培養基中混勻，以不加消泡劑的PDA培養基作為空白對照。1×105Pa下滅菌30 min，冷卻至50 ℃，在無菌條件下倒入培養皿中，待PDA培養基冷卻凝固后，用滅菌打孔器取直徑為5 mm的Tr148c菌體塊，分別接種于不同處理的平皿中央。每個處理3個平行，將平皿置于28 ℃培養箱中培養3 d。采用SPSS軟件，Duncan′s Multiple Range Test統計學方法分析，顯著性差異 (P≤ 0.05,n=3)統計各種消泡劑對菌株Tr148c生長的影響(相同字母表示無顯著性差異)，按下式計算生長抑制率：

式中：D0為空白對照Tr148c菌絲生長半徑；D為經消泡劑處理的Tr148c菌絲生長半徑。

1.2.5 消泡劑的消泡和抑泡能力的測定

消泡能力：在1 000 mL量筒中加入200 mL已發酵48 h的發酵液作為起泡液，以5 L·min-1的恒定速率通入空氣鼓泡，當泡沫高度達到量筒800 mL的位置時，迅速加入0.02%的消泡劑，同時用秒表記錄泡沫完全消失的時間。消泡時間短，即消泡劑的消泡能力強[9]。

抑泡能力：向1 000 mL量筒中加入200 mL上述發酵液、0.02%的消泡劑，攪拌均勻后以5 L·min-1的恒定速率通入空氣鼓泡，記錄10 min內泡沫的生成量。泡沫生成量少，即消泡劑的抑泡能力強[9]。

1.2.6 消泡劑用量及其對菌株Tr148c產孢量的影響

將篩選出的消泡劑在10 L發酵罐中進行用量(泡沫控制能力)及對菌株Tr148c產孢量影響的測試：在9個10 L發酵罐中，分別裝入6.5 L發酵培養液，加入0.1%篩選出的消泡劑(每種消泡劑做3個平行，隨機排列)，1×105Pa下滅菌20 min，冷卻至室溫，在無菌條件下加入4%的種子液，初始培養液的孢子量為2×106個·mL-1；同時將發酵罐在溫度28 ℃、通氣量5.8 L·min-1、攪拌速度250 r·min-1下培養144 h。用發酵罐中的消泡電極測定泡沫液位，以超過罐體80%為臨界點。每個發酵罐配備10%的消泡劑，當發酵罐中的泡沫液位超過罐體80%時，自動流加消泡劑。分別在發酵60 h、84 h和108 h時記錄消泡劑用量，測定孢子量。

將篩選出的綜合性能最好的消泡劑，用以上相同的測試方法在2個750 L發酵罐中進行重復性驗證實驗。發酵罐在溫度28 ℃、通氣量250 L·min-1、攪拌速度150 r·min-1下培養144 h。每個發酵罐配備10%的消泡劑，消泡劑用量的記錄和孢子量的測定同上。

2 結果與討論

2.1 消泡劑對菌株Tr148c生長的影響(圖1)

由圖1可以看出，當消泡劑用量為0.1%和0.4%時，GP-6303、T-30c、LX-601和LX-603對菌株Tr148c的生長抑制率都超過了30%，T-30c甚至超過了60%，顯著高于其它消泡劑對菌株Tr148c的生長抑制率(P≤0.05)；當消泡劑用量為0.7%時，GP-6303、T-30c、LX-601、LX-603和TSA-673對菌株Tr148c的生長抑制率分別為98.1%、67.76%、84.22%、71.76%和23.89%，顯著高于其它消泡劑對菌株Tr148c的生長抑制率(P≤0.05)；當消泡劑用量為0.1%時，GP-6301對菌株Tr148c的生長有一定的促進作用，當用量為0.4%和0.7%時，對菌株Tr148c的生長有一定的抑制作用。豆油、GPE-6330、L-101a和L-104a在任何用量下，對菌株Tr148c的生長不僅沒有抑制作用，相反有一定的促進作用。特別是豆油，隨著用量的增加，促生長作用不斷增強。因此，選擇豆油、GPE-6330、GP-6301、L-101a、L-104a進行消泡和抑泡能力的測定。

圖1 消泡劑對菌株Tr148c生長的影響

2.2 消泡劑的消泡和抑泡能力的測定結果(表1)

表1 消泡劑的消泡和抑泡能力的測定結果

Tab.1 Determination results of anti-foaming and foam- suppressing capabilities with defoaming agents

由表1可以看出，GPE-6330消泡能力顯著優于豆油和GP-6301(P≤0.05)。雖然L-101a、L-104a和GP-6301的消泡時間之間無顯著性差異，但它們都顯著少于豆油所用的消泡時間(P≤0.05)。同時GPE-6330、L-101a和L-104a的抑泡能力顯著優于GP-6301和豆油(P≤0.05)。因此，選擇GPE-6330、L-101a和L-104a進行10 L發酵罐實驗。

2.3 消泡劑的用量及其對菌株Tr148c產孢量的影響測定結果

在10 L發酵罐中進行菌株Tr148c的發酵實驗，消泡劑的用量及其對菌株Tr148c產孢量的影響見圖2。

圖2 消泡劑的用量(a)及其對菌株Tr148c產孢量(b)的影響

由圖2a可以看出，菌株Tr148c在10 L罐的發酵過程中，消泡劑L-101a、L-104a和GPE-6330的用量都隨著發酵時間的延長而增加，其中GPE-6330在發酵至84 h和108 h時的用量(145.2 mL、378.6 mL)都顯著少于L-104a的用量(170.6 mL、435.4 mL)(P≤0.05)，但顯著高于L-101a的用量(81.7 mL、173.4 mL)(P≤0.05)。

由圖2b可以看出，雖然菌株Tr148c的產孢量在所測試的3種消泡劑中，都隨著發酵時間的延長而增多，但當發酵時間達到84 h和108 h時，加入了L-101a的菌株Tr148c的產孢量(1.75×108個·mL-1、2.25×108個·mL-1)都顯著高于加入了L-104a的產孢量(0.95×108個·mL-1、1.45×108個·mL-1)和GPE-6330的產孢量(1.25×108個·mL-1、1.65×108個·mL-1)(P≤0.05)。表明，L-101a在10 L發酵罐中，不僅具有良好的消泡、抑泡作用，同時對菌株Tr148c的菌絲生長及產孢的影響最小。因此，選用L-101a在750 L發酵罐中進行重復性驗證實驗。

在符合工藝要求條件下，菌株Tr148c在750 L發酵罐中進行了兩批次發酵，最終產孢量分別為2.3×108個·mL-1和2.4×108個·mL-1，有機消泡劑L-101a用量分別為11.0 L和10.5 L，達到了測試的預期要求。

2.4 討論

雖然多種有機消泡劑已廣泛應用于發酵工業，但不同的發酵產品以及不同的發酵生產工藝所要求的有機消泡劑是不同的。朱文浩等[16]篩選了6種不同的有機消泡劑，測試它們對發酵液的消泡、抑泡能力，開發出了一種應用在糖蜜酒精發酵中的高效消泡劑。胡廷等[17]對4種有機消泡劑進行了篩選，選擇了一種有機硅消泡劑，應用在味精發酵生產中。

目前，國內外在消泡劑的性能測試方面尚無統一的方法和標準。優良的消泡劑不但具有消泡效率高、經濟成本低、安全無毒等特點[18]，同時還應具備在發酵過程中不引起發酵產物代謝異常、符合發酵生產的工藝要求、不影響產量并有利于發酵產物的后續處理等特征[5]。劉躍等[9]和魏浩等[19]根據消泡劑的消泡、抑泡能力以及它們對菌體生長和發酵物產量的影響，篩選出一種最佳消泡劑。由此可見，當選用的消泡劑與發酵物相容，同時還具有較好的消泡能力時，能提高發酵物的產量。本實驗選用有機硅類消泡劑L-101a用于棘孢木霉菌株Tr148c的液體發酵，用量少且對菌株的生長和分生孢子產量有促進作用。

3 結論

通過平板測試對10種消泡劑與棘孢木霉菌株Tr148c的相容性進行篩選，初篩出5種消泡劑進行消泡、抑泡能力測定，進而篩選出3種消泡劑GPE-6330、L-101a、L-104a進行10 L發酵罐實驗，考察了消泡劑用量及其對菌株Tr148c產孢量的影響，最終篩選出了L-101a作為菌株Tr148c液體發酵的最佳消泡劑。作為一種有機硅消泡劑，L-101a不僅與菌株Tr148c相容性好，在液體發酵過程中的用量少且消泡、抑泡能力顯著，同時對菌株Tr148c菌體生長和分生孢子的產量具有促進作用。

本研究初探了有機消泡劑在木霉菌發酵生產中的應用，為消泡劑進一步應用于木霉菌孢子制劑產業化生產提供了參考。

[1] 惠有為，孫勇，潘亞妮，等.木霉在植物真菌病害防治上的作用[J].西北農業學報，2003，12(3):96-99.

[2] 王英姿，祁之秋，魏松紅，等.綠色木霉菌固體發酵培養基優化組合正交篩選[J].植物保護，2007，33(2):61-63.

[3] 池玉杰，伊洪偉，艾志強，等.深綠木霉產孢條件優化[J].中國農學通報，2013，29(28):42-45.

[4] 王軍，曠文豐，陳晨，等.液體發酵因子對棘孢木霉Tr148c分生孢子產量的影響[J].安徽農業大學學報，2015,42(4)：595-599.

[5] 崔耀軍.消泡劑在BAA中溫α-淀粉酶生產中的應用研究[J].食品工業科技，2010，31(9):298-300.

[6] 覃先武，陳暉，匡金寶，等.消泡劑在面包酵母生產中的應用[J]. 釀酒科技，2006(12):87-89.

[7] 張路軍，田孝俊，井金峰，等.淺析谷氨酸發酵生產中泡沫的產生及消除[J].發酵科技通訊，2004，33(4):16-18.

[8] 葛成燦，王源升，余紅偉，等.泡沫及消泡劑的研究進展[J].材料開發與應用，2010，25(6):81-84.

[9] 劉躍，張紅蕊，趙林，等.纖維素堆囊菌發酵所用消泡劑的篩選[J].齊魯工業大學學報，2014，28(1):5-8.

[10] 周建，王軍峰，郝玉有，等.基于必特螺旋霉素發酵過程物理和生理作用的消泡劑篩選[J].江西農業大學學報,2008，30(3)：543-547.

[11] 李剛，周雪花，岳建芝，等.添加消泡劑對光合細菌生長和產氫量的影響[J].農業工程學報，2009，25(11):278-281.

[12] 黃振宏，陳子達.有機硅消泡劑在醫藥工業中的應用[J].江蘇科技信息，2014(23):91-94.

[13] 秦猛.消泡劑在中藥制藥中的應用[C]//第十二屆山東省藥劑學術會議論文集.青島:山東省藥學會，2006.

[14] 郭盛，劉智.有機硅消泡劑在抄紙中的應用[J].湖北造紙，2006(4):27-28.

[15] 馮建國，路福綏，武步華，等.有機硅消泡劑在農藥加工中的應用現狀和展望[J].農藥科學與管理，2010，31(1):30-33.

[16] 朱文浩，童嬉姈，陳朝毅，等.糖蜜酒精發酵中專用高效消泡劑的研究[J].甘蔗糖業，2012(2):38-40.

[17] 胡廷，張勇，孔德鈺.有機硅消泡劑的制備及在味精發酵中的應用[J].有機硅材料，2009，23(6):388-390.

[18] 李嘉瀅，何桂霞，呂晶森，等.消泡劑在酸棗仁皂苷濃縮過程中的應用[J].中成藥，2014,36(12):2517-2520.

[19] 魏浩，陸兆新，呂鳳霞，等.BacillusamyloliquefaciensES-2發酵產抗菌肽消泡劑的篩選及脂肽的提取和純化[J].中國生物工程雜志，2011，31(2):85-90.

Effect of Organic Defoaming Agent on Conidial Spore Production ofTrichodermaasperellumTr148c in Liquid Fermentation Process

MA Xiao-mei1，WANG Jun1,2，KUANG Wen-feng1，CHU Kai1，CHEN Chen1,MAO Wei-li1*

(1.ShanghaiW.L.H.Bio-techCo.，Shanghai201203,China；2.AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036,China)

InordertoscreenadefoamingagentusedintheliquidfermentationprocesswhichhadnosideeffectsonconidialsporeproductionofTrichoderma asperellumstrainTr148c，0.1%，0.4%，0.7%ofeachof10defoamingagentswererespectivelyaddedintoPDAculturemedium.ThegrowthinhibitoryratesofstrainTr148cweresignificantlylower(P≤0.05)inthetreatmentswiththedefoamingagentsofnaturaloil(soybeanoil)，polyether(GPE-6330，GP-6301)andorganicsilicon(L-101a，L-104a)comparedtotheothers.Defoamingtestswith5selectedagentswereconducted，andtheresultsshowedthattheanti-foamingandfoam-suppressingcapabilitiesofGPE-6330，L-101aandL-104aweresignificantlybetter(P≤0.05)comparedtotheothers.ThedosagesofGPE-6330，L-101aandL-104a，andeffectsofthemontheconidialsporeproductionofstrainTr148cwereinvestigated.Whenanti-foamingandfoam-suppressingeffectsmetthetechnicalrequirementsunderthesameconditions，thedosageofL-101aduringthefermentationprocesswassignificantlyless(P≤0.05)andhadnosideeffectsonconidialsporeproductionofstrainTr148ccomparedtothosewithGPE-6330andL-104a，respectively.

Trichodermaspp.;organicdefoamingagent;liquidfermentation;defoamingability

國家科技型中小企業技術創新項目(14C26213100929)

2016-10-13

馬曉梅(1987-)，女，黑龍江綏化人，碩士研究生，研究方向：微生物學，E-mail：759948123@qq.com；

毛偉力，博士，E-mail：weilimao@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.03.010

TQ458

A

1672-5425(2017)03-0040-05

馬曉梅,王軍,曠文豐,等.有機消泡劑對棘孢木霉菌株Tr148c液體發酵分生孢子產量的影響[J].化學與生物工程，2017，34(3)：40-44.