響應面法優化超聲輔助提取金銀花中綠原酸

蔣美麗，久保輝幸(日)，王正裔，郭 嘉

(武漢工程大學化工與制藥學院 綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430073)

響應面法優化超聲輔助提取金銀花中綠原酸

蔣美麗，久保輝幸(日)，王正裔，郭 嘉*

(武漢工程大學化工與制藥學院 綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430073)

采用超聲輔助乙醇從金銀花中提取綠原酸，通過單因素實驗考察pH值、料液比、乙醇體積分數和提取時間對綠原酸提取率的影響，采用響應面法優化提取工藝條件。確定最佳工藝條件為：pH值5.2、提取時間21 min、乙醇體積分數63%、料液比1∶13.5(g∶mL)。在該優化條件下，綠原酸的提取率達到10.862%。

金銀花；綠原酸；響應面法；超聲輔助提取

金銀花(Lonicera japonica)為忍冬科植物，在我國分布廣泛，具有較高的藥用價值[1-2]。綠原酸具有殺菌、抗病毒等作用，廣泛用于醫藥、保健、化工和食品等領域[3-5]。采用超聲波法提取金銀花中的綠原酸，不僅可以縮短提取時間，還能提高提取率[6-7]。響應面法(responsesurfacemethodology，RSM)是采用Design-Export優化軟件進行實驗設計與分析，用多元二次回歸方程近似擬合實驗中的多因素與指標之間的相互關系[8]，獲得最優條件。商小金等[9]通過響應面法對中藥延胡索中生物堿的提取工藝條件進行優化，獲得較好的效果。作者采用超聲輔助乙醇提取金銀花中的綠原酸，采用響應面法優化工藝條件。

1 實驗

1.1 材料與試劑

金銀花，河南省密縣。

綠原酸標準品、無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、蒸餾水(實驗室自制)。

1.2 方法

1.2.1 綠原酸標準曲線的繪制

精確稱量5mg綠原酸標準品放入50mL容量瓶中，加70%乙醇定容，配制成標準溶液。分別精密吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL標準溶液置于25mL容量瓶中，加70%乙醇定容，配制成不同濃度的系列綠原酸標準溶液。采用紫外分光光度計在200～400nm范圍內掃描，測出綠原酸的最大吸收波長為328nm。在328nm波長處測定系列綠原酸標準溶液的吸光度，以吸光度A為縱坐標、濃度c為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.2 綠原酸提取率的計算

根據下式計算綠原酸的提取率：

式中：c為綠原酸濃度，μg·mL-1；V為樣液體積，mL；n為提取液的稀釋倍數；m為樣品質量，g。

1.2.3 單因素實驗

將金銀花打磨成粗粉。準確稱取2.5 g金銀花粗粉置于250 mL錐形瓶中，加入適量一定體積分數的乙醇溶液。將錐形瓶置于超聲波清洗器中提取綠原酸，抽濾，收集濾液，測定綠原酸含量。

分別取pH值3～8、乙醇體積分數50%～90%、料液比1∶(6～14)(g∶mL，下同)以及提取時間10～50 min進行單因素實驗。

1.2.4 響應面法實驗

根據單因素實驗結果，選擇影響綠原酸提取效果比較顯著的4個因素：pH值、料液比、乙醇體積分數和提取時間為考察對象，以綠原酸提取率(Y)為響應值進行響應面優化實驗，其因素與水平見表1。

表1 響應面法實驗的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of RSM experiment

2 結果與討論

2.1 綠原酸的標準曲線(圖1)

根據圖1擬合綠原酸的回歸方程：A=0.03187c-0.01272(R2=0.99905)，綠原酸的吸光度在4～24μg·mL-1的濃度范圍內表現出較好的線性關系。

圖1 綠原酸的標準曲線

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 pH值的影響(圖2)

圖2 pH值對綠原酸提取率的影響

由圖2可知，綠原酸的提取率隨著pH值的增大先升高后降低，在pH值為5時提取率最高。這是因為，在堿性條件下綠原酸發生了水解，導致提取率降低。因此，pH值取5較適宜。

2.2.2 乙醇體積分數的影響(圖3)

圖3 乙醇體積分數對綠原酸提取率的影響

由圖3可知，綠原酸提取率隨著乙醇體積分數的增大先升高后降低，乙醇體積分數達到70%時提取率最高。這是因為，不同體積分數的乙醇對金銀花中有效成分的解析能力不同，過高會增加醇溶性雜質的溶出，過低會減少綠原酸的溶出。因此，乙醇體積分數取70%較適宜。該結論與肖卓炳等[10]的結論一致。

2.2.3 料液比的影響(圖4)

圖4 料液比對綠原酸提取率的影響

由圖4可知，隨著料液比的減小(即溶劑量的增加)，綠原酸的提取率逐漸升高；當料液比為1∶12時，提取率達到最高；繼續減小料液比，綠原酸的提取率反而下降。這是由于，在相同的超聲加熱時間內，體系的溶劑量大，溫度就比較低，影響溶質在溶劑中的擴散，提取率降低。因此，料液比取1∶12較適宜。

2.2.4 提取時間的影響(圖5)

圖5 提取時間對綠原酸提取率的影響

由圖5可知，隨著提取時間的延長，綠原酸的提取率先升高后降低，在30 min時達到最高。這是因為，隨著提取時間的延長，提取液中的雜質會大量增多，綠原酸的提取率降低。因此，提取時間取30 min較適宜。

2.3 響應面法實驗結果

2.3.1 響應面法實驗設計方案

根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理，共進行29個實驗點的響應面實驗，結果見表2。

表2 響應面法實驗結果

Tab.2 Results of RSM experiment

2.3.2 響應面法實驗結果的方差分析(表3)

表3 響應面法實驗結果的方差分析

Tab.3Variance analysis of RSM results

注：*表示差異在0.05水平上顯著；**表示差異在0.001水平上非常顯著。

從表3可知，模型的P<0.0001，說明回歸方程非常顯著；模型的相關系數R2=0.9653，表明實驗中96.53%的數據是合理的；失擬項F=1.44、P=0.3862，大于0.01不顯著，表明方程具有很好的模擬性；變異系數0.52%小于10%，表明該模型的可信度和精確度高；方程的精密度等于21.643，大于4視為合理[11]，所以此模型是合理的，適應性較好，可以用于該實驗。

2.3.3 響應面圖分析

根據二元回歸方程生成等高線圖和三維響應面曲線，各因素之間的交互作用可以被直觀反映，見圖6～圖9。

從圖6、8、9中可以看出，X1X2、X1X4、X2X3之間的交互作用不明顯。從圖7可以看出，等高線中心呈橢圓形，則X1X3之間的交互作用較明顯。該實驗的響應面圖均開口向下，4個制約因素和提取率呈拋物線關系，在實驗范圍內出現最大值。采用軟件優化，獲得最佳實驗條件：pH值5.22、提取時間21.28 min、乙醇體積分數62.90%、料液比1∶13.55，綠原酸提取率的理論預測值為10.858%。

2.4 響應面驗證實驗

考慮到實際操作，驗證實驗時將最佳條件修正為：pH值5.2、提取時間21 min、乙醇體積分數63%、料液比1∶13.5。利用修正后的實驗條件進行3次平行實驗，綠原酸平均提取率為10.862%，和理論預測值相對誤差為0.037%，差異不顯著，表明響應面法確定的實驗條件是穩定可行的。

圖6 pH值和料液比對綠原酸提取率的交互影響

圖7 pH值和乙醇體積分數對綠原酸提取率的交互影響

圖8 pH值和提取時間對綠原酸提取率的交互影響

圖9 料液比和乙醇體積分數對綠原酸提取率的交互影響

3 結論

通過單因素實驗和響應面法實驗確定金銀花中綠原酸超聲輔助提取的最佳工藝條件為：pH值5.2、提取時間21 min、乙醇體積分數63%、料液比1∶13.5(g∶mL)。在該條件下綠原酸的提取率達到10.862%。該優化工藝模型準確可靠，提取率較高，具有現實指導意義。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Chlorogenic Acid fromLoniceraJaponicaby Response Surface Methodology

JIANG Mei-li，Teruyuki KUBO (Japan)，WANG Zheng-yi，GUO Jia*

(KeyLaboratoryforGreenChemicalProcessofMinistryofEducation，SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy，WuhanInstituteofTechnology，Wuhan430073，China)

ChlorogenicacidfromLonicera japonicawasextractedusingultrasonic-assistedethanol.TheeffectsofpHvalue，solid-liquidratio，ethanolvolumefractionandextractiontimeontheextractionrateofchlorogenicacidwasdiscussedbyasinglefactorexperiment，andtheextractionconditionswereoptimizedbyresponsesurfacemethodology.Theoptimumconditionswereasfollows:pHvalue5.2，extractiontime21min，ethanolvolumefraction63%，solid-liquidratio1∶13.5(g∶mL).Undertheoptimumconditions，theextractionrateofchlorogenicacidreached10.862%.

Lonicera japonica；chlorogenicacid；responsesurfacemethodology；ultrasonic-assistedextraction

教育部“新世紀優秀人才支持計劃”(NCET-05-0681)，武漢工程大學第10期大學生校長基金資助項目(2015017)

2016-10-26

蔣美麗(1990-)，女，河南永城人，碩士研究生，研究方向：天然產物分離與提取；

郭嘉，湖北省“楚天學者”計劃特聘教授，博士生導師，E-mail：guojia@wit.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.03.009

TQ461 R284.2

A

1672-5425(2017)03-0035-05

蔣美麗，久保輝幸(日)，王正裔，等.響應面法優化超聲輔助提取金銀花中綠原酸[J].化學與生物工程，2017，34(3)：35-39，44.