魷魚肌肉蛋白肽的制備工藝優化及其抗氧化活性

胡小軍,江 敏,莫秋遠,王標詩,苗碗根

(嶺南師范學院化學化工學院 廣東高校新材料工程技術開發中心,廣東湛江 524048)

魷魚肌肉蛋白肽的制備工藝優化及其抗氧化活性

胡小軍,江 敏*,莫秋遠,王標詩,苗碗根

(嶺南師范學院化學化工學院 廣東高校新材料工程技術開發中心,廣東湛江 524048)

魷魚,抗氧化肽,抗氧化活性,響應面分析

自由基具有強氧化性,可損害機體的組織和細胞[1-2],引起衰老和慢性疾病[3],如心血管疾病、癌癥、糖尿病及其它各種相關疾病[4]。在這種情況下,就需要及時補充抗氧化劑來清除過量的自由基,緩解自由基對機體造成的損傷。機體從體外獲得的抗氧化劑按其來源可分為化學合成抗氧化劑和天然抗氧化劑大兩類。合成抗氧化劑具有較強抗氧化能力,但是對人體有多種潛在的危害,所以開發天然抗氧化劑成為營養學研究的熱點。抗氧化肽是天然抗氧化劑的一種,由于其安全、功能及易吸收,成為目前天然抗氧化劑開發的熱點。制備抗氧化肽的方法常用酶解法,與化學法相比具有反應條件溫和,不產生有毒副產物、無氨基酸破壞以及高效、易控等優點被廣泛應用[5]。水產資源富含蛋白質,是開發抗氧化肽非常好的原料[6],如利用扇貝和鯰魚開發抗氧化肽[7-8]。魷魚,其學名為中國槍烏賊,含有豐富的氨基酸,且人體必需氨基酸比重很大,是一種營養保健型漁業資源,極具營養價值。目前,國內魷魚深加工方法不多,且產品附加值較低[9]。有文獻報道采用還原力為指標,正交旋轉組合優化中性蛋白酶酶解魷魚制備抗氧化肽,但是未對抗氧化肽進行抗氧化活性研究[10]。本文以魷魚為材料,以清除羥自由基為指標,采用響應面法優化魷魚蛋白質酶解制備抗氧化肽工藝,同時對所得抗氧化肽進行抗氧化活性的研究,以期為魷魚深加工開發抗氧化肽以及抗氧化肽清除自由基預防氧化衰老提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魷魚 湛江南華市場,洗凈后絞成肉糜,置于-18 ℃冰箱中冷凍,備用。

超氧化物歧化酶試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒 南京建成生物工程研究所;蛋白酶:木瓜蛋白酶(6000 U/mg) 北京索萊寶科技有限公司;胰蛋白酶(1500 U/mg)、復合蛋白酶(2500 U/mg) 上海一基實業有限公司;DPPH Sigma公司;其他試劑均為分析純。

Cintra10紫外可見分光光度計 澳大利亞GBC公司;centrifuge5810R 冷凍離心機 德國Eppendorf(艾本德)公司;MP1100B電子天平 上海濟成分析儀器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魷魚抗氧化肽制備工藝流程 魷魚肉→絞成肉糜→冷凍備用→解凍→加入適量蛋白酶→在蛋白酶的最適條件下進行酶解(見表1)→將酶解液在沸水浴中滅酶15 min→冷卻→離心(4800 r/min,20 min)→上清液→濾膜過濾(0.45 μm)→透析處理(3500 u)→透過液→濃縮→冷凍干燥→魷魚抗氧化肽。

表1 不同酶水解魷魚蛋白的工藝條件(相同酶活力條件)

1.2.2 魷魚酶解最佳酶的篩選及單因素實驗 精確稱取3份10 g魷魚肉糜,加入100 mL pH8.0、5.8、6.8緩沖液,再分別加入表1三種酶,分別在45、55和50 ℃下,酶解3 h,酶解結束,將酶解液置于沸水浴中滅酶15 min,然后用自來水冷卻到室溫,再在4800 r/min條件下,低溫離心20 min得上清液,經過濾、透析以及濃縮干燥得到魷魚多肽,測定清除羥自由基,篩選得到酶解最佳用酶。采用最佳酶,進行單因素實驗,分別考察酶解時間、加酶量以及酶解溫度對羥自由基清除率的影響。

1.2.3 響應面法優化魷魚蛋白酶解工藝條件 根據的Box-Behnken 實驗設計原理,精確稱取10 g魷魚肉糜,以羥自由基清除率為指標(Y),綜合單因素實驗結果,選取酶解時間、加酶量、酶解溫度三個對抗氧化肽抗氧化活性影響最大的因素,對魷魚蛋白酶解工藝條件進行響應面分析,因素水平表見表2。

表2 響應面法優化酶解工藝各因素和水平設計

1.2.4 魷魚抗氧化肽抗氧化活性實驗 清除DPPH·活性,采用Zhu等報道的方法[11],分別取2 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液置于6支試管中,分別加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL抗氧化肽溶液,使濃度分別達到5、10、15、20、25、30 mg/mL,同時補充蒸餾水至4 mL,室溫放置30 min后,在517 nm處測定其吸光度值(Ai),以2 mL 95%乙醇加入2 mL蒸餾水調零,對照為2 mL DPPH·溶液加上2 mL 95%乙醇在517 nm測定吸光度值(Ac),不同濃度的抗氧化肽溶液和2 mL 95%乙醇混合后在517 nm測定吸光度值(Aj)。抗氧化肽對DPPH·的清除率用抑制率表示為:

R(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式(1)

清除·OH活性,采用鄰二氮菲法測定抗氧化肽清除羥自由基活性[12]。測定方法如下:

取6支試管,分別加入0.6 mL鄰二氮菲溶液(5 mmol/L)加入0.4 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH7.4)混勻后,分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL抗氧化肽溶液(濃度達到5、10、15、20、25、30 mg/mL)及0.6 mL EDTA(15 mmol/L),再次混勻后加入0.6 mL FeSO4溶液(5 mmol/L),以去離子水補至體積2.8 mL,充分混勻后加入0.8 mL H2O2(0.1%),搖勻后于37 ℃保溫1 h,在536 nm處測吸光度值A樣品。以去離子水代替樣品,其余步驟同樣品管,測得吸光度值為A損傷。以去離子水代替H2O2,其余步驟同損傷管,所測得吸光度值為A未損傷。按照下式計算OH·清除率:

清除率(%)=(A樣品-A損傷)/(A未損傷-A損傷)×100

式(2)

清除率(%)=(A0-A1)/A0×100

式(3)

其中:A0-鄰苯三酚自氧化速率;A1-抗氧化肽抑制鄰苯三酚自氧化速率。

小鼠體內抗氧化活性實驗,參考王碩等的方法[14],略加修改。將60只實驗小鼠隨機分成三組,分別是對照組(control)、魷魚抗氧化肽高劑量組(SAP-H)和低劑量組(SAP-L),每組20只。小鼠適應飼養一周后,制備衰老模型,三組每天注射D-半乳糖,注射劑量100 mg/g。SAP-H和SAP-L組每天灌胃魷魚抗氧化肽溶液,劑量分別為20 mg/g和5 mg/g,對照組每天灌胃等量鹽水,連續給藥48 d,期間小鼠自由攝食飲水,每天稱量體重,根據體重調整灌胃劑量。末次給藥后,禁食24 h,小鼠摘眼球取血,4 ℃冰箱靜置12 h,3000 r/min 低溫離心10 min,取上層血清,測定超氧化物歧化酶和谷胱甘肽酶活性。

1.3 數據統計分析

所有實驗重復3次以上,采用Excel和SPSS19.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶酶解效果篩選及單因素實驗

三種蛋白酶酶解魷魚蛋白結果見圖1,在相同酶活和相同酶解時間條件下,木瓜蛋白酶所得抗氧化肽對羥自由基清除率最高,達到63.08%±0.63%,而另外兩種蛋白酶清除率相對較低。所以選擇木瓜蛋白酶作為酶解用酶。魷魚蛋白酶解單因素結果見圖2、圖3和圖4,由圖可知,不同魷魚蛋白酶解條件對羥自由基清除率影響都有先增后減小的趨勢,同時說明魷魚蛋白酶解過程具有最佳的反應條件。從圖2可以看出,隨著酶解時間的延長,清除率呈現增大趨勢,5.5 h后開始降低,所以5.5 h是最佳酶解時間。圖3可以看出,加酶量0.06 g/10 g是影響清除率的變化點,所以加酶量為0.06 g/10 g為最佳用酶量。從圖4看出,酶解溫度在55 ℃,羥自由基的清除率達到最大值,所以選擇55 ℃為最佳酶解溫度。

圖1 不同蛋白酶對羥自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of different protease against OH·

圖2 不同酶解時間對羥自由基清除率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on scavenging rate of OH·

圖3 不同加酶量對羥自由基清除率的影響Fig.3 Effect of amount of enzyme on scavenging rate of OH·

圖4 不同溫度對羥自由基清除率的影響Fig.4 Effect of temperature on scavenging rate of OH·

2.2 響應面優化魷魚蛋白酶解工藝

2.2.1 響應面實驗結果 按照1.2.2和1.2.3方法進行響應面設計,具體實施方案和結果見表3。

表3 RSM優化魷魚蛋白酶解方案與實驗結果

根據實驗結果建立的數學模型為:(Y)=-9.37808+0.66028A+54.39442B+0.35765C-2.75844AB+8.98240×10-4AC+0.18288BC+0.044141×A2-348.56100B2-3.33348×10-3C2

2.2.2 模型方差分析 為了檢驗回歸方程的有效性,對回歸模型進行方差分析,結果見表4,從分析結果可以看出,模型p=0.001,回歸模型極其顯著;在三個因素當中,酶解時間、加酶量對羥自由基清除率影響最為顯著(p<0.001);失擬項p=0.0568,不顯著,同時回歸模型的相關系數R2=0.9770,響應值的97.70%與所選變量有關系,說明模型擬合程度良好,能較準確地預測和分析實際情況。

2.2.3 最優條件及驗證實驗 根據所建立的數學模型進行參數最佳化分析,得酶解產物清除羥自由基活性最強所需的參數條件為:酶解時間為5.77 h,加酶量為0.07 g/10 g、酶解溫度為54.77 ℃,清除率預測值為92.02%。將實驗條件修正為:酶解時間6 h,加酶量為0.07 g/10 g,酶解溫度為55 ℃,進行驗證實驗得羥自由基清除率為90.31%±0.54%,該結果與預測值差值僅占預測值的1.86%。由此認為該二次模型合理,實驗結果較為理想。

表4 響應面二次模型方差分析

注：p<0.05,差異顯著;p<0.01,差異極顯著。

2.3 抗氧化活性實驗

2.3.1 清除DPPH·活性 魷魚抗氧化肽清除DPPH·結果見圖5。由圖5可知:魷魚抗氧化肽對DPPH·有明顯的清除能力,且隨濃度的增加清除效果增強,存在明顯量效關系。當抗氧化肽濃度達到30 mg/mL,其對DPPH·清除率達到92.06%±0.87%。抗氧化肽濃度與DPPH·清除率擬合曲線為:y=2.109x+31.375,其相關系數為R2=0.9873。魷魚抗氧化肽清除DPPH·的EC50(半數清除率)值為8.8 mg/mL。

圖5 抗氧化肽對DPPH·清除效果Fig.5 The scavenging effect of antioxidant peptide against DPPH

2.3.2 清除·OH活性 魷魚抗氧化肽清除·OH結果見圖6。由圖6可以看出:隨著抗氧化肽濃度的增加,對·OH的清除率也呈現增加趨勢;當抗氧化肽濃度為30 mg/mL時,對·OH的清除率為81.00%±0.73%。在實驗范圍內,濃度與自由基的清除率擬合的曲線為:y=2.8543x-3.0333,其相關系數R2=0.9914。魷魚抗氧化肽清除·OH的EC50值為16.5 mg/mL。

圖6 抗氧化肽對·OH清除效果Fig.6 The scavenging effect of antioxidant peptide against ·OH

圖7 抗氧化肽對·清除效果Fig.7 The scavenging effect of antioxidant peptide against ·

2.3.4 體內抗氧化活性 小鼠體內抗氧化活性結果見圖8,魷魚抗氧化肽高低劑量組的小鼠體內SOD活性分別比空白組高19.2%和14.2%。而抗氧化肽高低劑量組小鼠體內的GSH比空白組提高了23.4%和14%。說明魷魚抗氧化肽能提高小鼠體內抗氧化酶的活力,促進衰老過程中產生的自由基的清除,具有較強的體內抗氧化活性。

圖8 抗氧化肽對小鼠體內抗氧化酶活性的影響Fig.8 Effect of antioxidant peptide on the activities of enzymes

3 結論

采用酶解技術對魷魚蛋白進行酶解制備抗氧化肽,通過Box-Behnken 實驗設計以及響應面分析對魷魚蛋白酶解工藝進行優化,得出最佳酶解工藝條件為酶解時間6 h,加酶量為0.07 g/10 g,酶解溫度為55 ℃,在此條件下得到魷魚抗氧化肽的羥自由基清除率為90.31%±0.54%,同時得到清除率與酶解各因素變量的二次方程模型,該回歸模型極顯著,對于實驗擬合較好。

通過體內體外抗氧化活性實驗,得出魷魚抗氧化肽對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基有較強的清除作用,EC50值分別是8.8、16.5 mg/mL和10.3 mg/mL。通過小鼠體內抗氧化實驗,和對照組相比,魷魚抗氧化肽能提高衰老小鼠的SOD酶和谷胱甘肽酶的活性,拮抗D-半乳糖導致衰老小鼠的氧化損傷,表明魷魚抗氧化肽具有很好的抗氧化活性。

[1]Yin Huiyong,Zhu Mingjiang. Free radical oxidation of cardiolipin:chemical mechanisms,detection and implication in apoptosis,mitochondrial dysfunction and human diseases[J]. Free Radical Research,2012,46(8):959-974.

[2]Olchawa Magdalena M,Pilat Anna K,Szewczyk Grzegorz M,et al. Inhibition of phagocytic activity of ARPE-19 cells by free radical mediated oxidative stress[J]. Free radical research,2016,50(8):887-897.

[3]Mamelona J,Saint-Louis R,Pelletier E. Nutritional composition and antioxidant properties of protein hydrolysates prepared from echinoderm byproducts. International Journal of Food Science and Technology,2010,45:147-154

[4]Kikuchi Kiyoshi,Takeshige Nobuyuki,Miura Naoki,et al. Beyond free radical scavenging:Beneficial effects of edaravone(Radicut)in various diseases(Review)[J]. Experimental and Therapeutic Medicine,2012,3(1):3-8.

[5]Zhuang Hong,Tang Ning,Dong Shu-ting,et al.Optimization of antioxidant peptide preparation from corn gluten meal[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2013,93(13):3264-3270.

[6]L. Najafian,A.S. Babji.A review of fish-derived antioxidant and antimicrobial peptides:Their production,assessment,and applications[J].Peptides,2012(33):178-185.

[7]劉媛,王健,牟建樓,等.扇貝貝肉抗氧化肽的制備及體外抗氧化實驗研究[J].食品工業科技,2014,35(8):206-208.

[8]王軍,王忠合,王曉麗.超聲波輔助酶解鯰魚肉制備抗氧化肽及其活性評價[J].食品工業科技,2014,35(21):197-201.

[9]吳少杰,張俊杰,姚興存,等.我國魷魚的綜合加工利用現狀與展望[J].食品研究與開發,2011,32(1):154-156.

[10]宋茹,謝超,崔曉旭.酶解法制備魷魚蛋白抗氧化肽工藝優化[J].浙江海洋學院學報,2009,28(3):311-314.

[11]Zhu B W,Zhou D Y,Li T,et al. Chemical composition and free radical scavenging activities of a sulphated polysaccharide extracted from abalone gonad(Haliotis Discus Hannai Ino)[J]. Food Chemistry,2010,121(3):712-718.

[12]Motoko Ohata,Saeko Uchida,Lanxi Zhou,et al. Antioxidant activity of fermented meat sauce and isolation of an associated antioxidant peptide[J]. Food Chemistry,2016(194):1034-1039.

[13]何小慶,曹文紅,章超樺,等.波紋巴非蛤蛋白酶解產物的抗氧活性及分子量分布研究[J].現代食品科技,2014,30(1):74-80.

[14]王碩,司建志,龔小妹,等.八角茴香總黃酮抗氧化活性研究[J].食品工業科技,2015,36(23):75-78.

Optimization of preparation technology and antioxidant activity of squid protein peptides

HU Xiao-jun,JIANG Min*,MO Qiu-yuan,WANG Biao-shi,MIAO Wan-gen

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Lingnan Normal University,Development Center for New Materials Engineering & Technology in Universities of Guangdong,Zhanjiang 524048,China)

The effects of enzymatic hydrolysis time,temperature,and amount of enzyme on the removal of hydroxyl radical from squid muscle were investigated. The enzymatic technology of squid protein was optimized by Box-Behnken design and response surface methodology(RSM). In the meantime,the antioxidant activities of squid antioxidant peptides were studied by using free radical scavenging and antioxidant activity in mice. The results showed that the hydroxyl radical scavenging rate was significantly affected by time and amount of enzyme. The optimum conditions were enzymatic hydrolysis time 6 h,amount of enzyme 0.07 g/10 g,enzymolysis temperature 55 ℃,under which the hydroxyl radical scavenging rate was 90.31%±0.54%. The EC50of antioxidant peptide from squid against DPPH radical,hydroxyl radical and superoxide anion radical were 8.8,16.5mg/mL and 10.3mg/mL,respectively. SOD activity of Squid antioxidant peptide in the high and low dose group mice was higher than the control group of 19.2% and 14.2%. GSH activity of Squid antioxidant peptide in the high and low dose group mice was higher than the control group of 23.4% and 14%. Squid antioxidant peptides had strong antioxidant activity through antioxidant experimentsinvitroandinvivo.

squid;antioxidant peptide;antioxidant activity;response surface analysis

2016-09-06

胡小軍(1977-),男,碩士,講師,研究方向：食品的深加工與功能成分制備,E-mail:yan2001j@126.com。

*通訊作者:江敏(1977-),女,碩士,實驗師,研究方向：食品加工技術與產品開發,E-mail:jiangmin9715@163.com。

國家級星火計劃項目(2013GA780083);湛江市財政資金科技專項項目(2013C01029);2013年地方高校國家級大學生創新創業訓練項目(2010404139);嶺南師范學院熱帶與南海資源協同創新中心項目(CIL1503);嶺南師范學院自然科學研究項目(YL1404)。

TS254.1

B

1002-0306(2017)05-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.027