半纖維素降解菌J-25的篩選、鑒定及產酶特性研究

姜立春,王成紅,劉 羽,林壽露,趙麗萍,阮期平

(綿陽師范學院分子生物學與生物制藥重點實驗室,四川綿陽 621000)

半纖維素降解菌J-25的篩選、鑒定及產酶特性研究

姜立春,王成紅,劉 羽,林壽露,趙麗萍,阮期平*

(綿陽師范學院分子生物學與生物制藥重點實驗室,四川綿陽 621000)

以腐爛的木材為菌源,經過初篩、復篩,采用半纖維素水解圈法和胞外酶測定法進行菌株篩選獲得一株半纖維素高效降解菌株J-25。通過對菌株J-25的16S rDNA進行測序分析,鑒定為纖維單胞菌屬命名為Cellulomonassp. J-25。對菌株J-25進行產酶條件和酶學性質研究,結果表明:菌株J-25發酵產酶的優化條件為:培養時間為60 h、溫度30 ℃、初始pH為7.0、麩皮濃度為20 g/L、酵母粉濃度為10 g/L、裝液量為50 mL(250 mL三角瓶),半纖維素酶活性可達到62.8 U/mL。最適酶反應條件為:pH為6.5、溫度為40 ℃、底物濃度為15 g/mL、反應時間為30 min。這些將為半纖維素的生物降解提供實驗依據。

半纖維素,降解菌,產酶條件,酶學性質,16S rDNA

半纖維素是植物性材料的有效組成成份之一,約占15%～30%,是陸生植物細胞壁的一種主要組分,較集中于初級與次級細胞壁中。半纖維素是由己糖與戊糖構成的異質多糖[1],探討半纖維素生物轉化具有重要的實踐價值,如在生物制漿,將其轉化為單糖和酒精,處理造紙廠廢水的環境污染等方面具有廣泛的應用前景[2]。半纖維素酶是分解半纖維素的一類酶的總稱,主要由內切酶、外切酶和糖苷水解酶組成[3]。微生物產生的半纖維素酶將半纖維素降解產生術糖和其它少量單糖[4]。有利于廢棄農作物還田,改善植物的營養狀況,還能夠使農作物抵抗某些病原微生物的致病作用,減輕病蟲害,增加產量[5]。全桂靜等[5]使用半纖維素作為唯一碳源,通過平板水解圈與搖瓶發酵相結合方法,篩選分離純化到1株半纖維素酶高產菌株Hc-3,鑒定該菌株屬于曲霉屬(Aspergillus)。張慶芳等[6]以木聚糖作為唯一碳源,分離獲得1株降解半纖維素中木聚糖的高效菌株,經形態學和分子生物學鑒定為曲霉屬(Aspergillus)。張寧寧等[7]以半纖維素為唯一碳源,從溫泉中分離到1株降解半纖維素酶的嗜熱菌DT-1,經16S rDNA序列比較分析,初步鑒定該菌株屬于Geobacillusthermocatenulatus。

本研究以腐朽木材為菌源,篩選獲得的一株半纖維素降解菌進行了菌株鑒定和發酵條件優化,并對酶學性質進行了分析,以期提高半纖維素酶的活性,為纖維的生物降解提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣本采集 使用無菌取樣鏟采集腐爛木材或長期存放木材下面的土壤作為篩選菌源,用無菌袋包裝帶回實驗室,于4 ℃冰箱中保存,備用。

1.1.2 主要儀器和試劑 PCR儀器(Thermol Research Inc);Gel-Doc XR分子凝膠成像系統(BIO-RAD);高速冷凍離心機(Eppendorf);凈化工作臺(SB-JC-1A);紫外分光光度計(Uitrospec 3300pro);恒溫培養搖床(HZ-9211K);微量可調移液器(Eppendorf)等。

pMD18-T試劑盒、X-gal和IPTG、DNA膠回收試劑盒和氨芐青霉素購自上海生物工程技術服務有限公司,引物的合成和DNA測序由上海生物工程技術有限公司完成,DNS試劑、木聚糖溶液。

1.1.3 培養基及配方 初篩培養基(100 mL):木聚糖0.5 g,酵母粉0.1 g,KH2PO40.1 g,NH4NO30.1 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,NaCl 0.5 g,瓊脂1.5 g。

透明圈測定培養基(100 mL)[8]:K2HPO42.0 g,NH4NO32.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,酵母膏5.0 g,半纖維素20.0 g,pH7.2。

發酵產酶培養基(100 mL):木聚糖0.5 g,KH2PO40.1 g,NH4NO40.4 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,NaCl 0.5 g。

牛肉膏蛋白胨培養基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5g,瓊脂2.2%,水1000 mL,pH7.4～7.6,固體平板加2.0%瓊脂。上述培養基均在121 ℃滅菌 20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株篩選 將樣品制成菌懸液。將菌懸液稀釋后均勻涂布于篩選平板上,27 ℃恒溫培養3 d,將純化后的單菌落點種于透明圈培養基上,27 ℃恒溫培養,測量水解圈的直徑D(mm)及菌落的直徑d(mm),并計算D/d值,進行初篩。復篩測定發酵液酶活力。

1.2.2 菌種鑒定

1.2.2.1 形態觀察 將細菌在牛肉膏蛋白胨培養基平板上培養32 ℃培養30 h后進行菌落形態觀察,放于4 ℃冰箱中保存。選擇單一菌落進行革蘭氏染色,鏡檢觀察其顯微結構。

1.2.2.2 生理生化 菌株J-25生理生化實驗參照文獻[9]中的方法。依據《常見細菌系統鑒定手冊》,對篩選獲得的菌株J-25進行初步鑒定。

1.2.2.3 DNA提取與擴增16S rDNA基因 細菌基因組DNA提取:提取基因組DNA參考Kim等[10]方法,對其方法略有修改。0.9%瓊脂糖電泳檢測。

采用細菌通用引物P27f:5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′,P1492r:5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′對菌株進行16S rDNA基因片段擴增。PCR反應體系:37.5 μL ddH2O、5.0 μL 10×PCR buffer、4 μL dNTPs(各2.5 mmol/L)、1.0 μL P27f引物(20 pmol/μL)、1.0 μL P1492r引物(20 pmol/μL)、2 μL模板、0.5 μL TaqDNA聚合酶,反應總體積為50 μL。擴增熱循環體系:94 ℃預變性4 min,94 ℃變性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸50 s;經35個循環后,72 ℃延伸18 min。PCR擴增產物經電泳檢測后,其產物回收純化與pMD-19T載體連接,轉入感受態細胞JM109,篩選陽性重組子郵寄上海英俊生物科技有限公司測序。

1.2.2.4 16S rRNA序列分析與系統進化樹構建 將菌株的16S rDNA序列在NCBI數據庫中進行Blast序列比對與相似性分析,下載與該序列相似性較高的核酸序列用于系統進化樹分析。將在數據庫中下載的相關菌株16S rRNA序列,采用Clustal X軟件包[11]進行多序列比對分析,用Mega 6.0軟件程序中的Neighbor-Joining法進行聚類分析和構建系統進化樹[12]。

1.2.3 半纖維素酶活性測定 粗酶液1.0 mL,加1.5 mL pH=4.8的1%木聚糖溶液(對照用1.0 mL稀釋酶液加3.0 mL pH=4.8的醋酸緩沖液,不加木聚糖溶液),50 ℃水溶60 min,取出后,再吸取4.0 mL DNS試劑搖勻,立即沸水浴反應10 min,冷卻后,補加水定容到25 mL,于550 nm下測OD值。一個半纖維素酶單位定義為:1.0 mL酶液于50 ℃ pH=4.8條件下,每分鐘分解1.0%木聚糖溶液產生一微克還原糖(以木糖)的酶量定義為一個半纖維素酶活力單位。酶活力計算公式:U=(A×N×1000)/60,式中:A=OD550 nm下的吸收值相對應的木糖濃度;N=酶的稀釋倍數。

1.2.4 產酶條件優化 在發酵培養基的基礎上通過改變單一因素,并保持其他發酵條件不變,以下實驗每個條件制作三個平行。培養時間:將菌株J-25接入產酶培養基中(接種量為1%)。置于32 ℃ 160 r/min搖床上進行培養,觀察并記錄其生長狀況,每12 h測定記錄一次,共5 d;碳源(濃度10 g/L)分別為麩皮、玉米粉、半纖維素、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖,在碳源確定的基礎上,實驗在5、10、15、20、25和30 g/L條件下分析碳源濃度;而氮源(濃度5 g/L)為蛋白胨、豆粕、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨,在氮源確定的基礎上,實驗在1、5、10、15和20 g/L條件下分析氮源濃度;實驗考察不同初始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10),不同裝液量(10、30、50、80、100、120 mL/250 mL三角瓶),不同培養溫度(20、24、27、30、33、37、40 ℃)等條件對該菌株產酶的影響[13-14]。

1.2.5 酶學性質初步研究

1.2.5.1 pH對酶活力的影響 pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的1.0%木聚糖溶液1.5 mL分別加入粗酶液0.5 mL,搖勻,50 ℃水浴60 min,取出后,用DNS法測定酶活力。

1.2.5.2 溫度對酶活力的影響 調節最適pH,使酶反應體系在10、20、30、40、50、60 ℃下保溫60 min,取出后,用DNS法測定不同溫度下的酶活力。

1.2.5.3 底物濃度對酶活力的影響 濃度為1、5、10、15、20 g/L的木聚糖溶液1.5 mL,分別加入粗酶液0.5 mL,搖勻,50 ℃水浴60 min,取出后,用DNS法測定酶活力。

1.2.5.4 反應時間對酶活力的影響 調節最適pH,使酶反應體系在50 ℃水浴鍋中分別保溫10、20、30、40、50、60 min,取出后,用DNS法測定酶活力。

1.3 數據統計分析

測定結果利用Microsoft Excel軟件制圖以及進行統計學分析,實驗每個條件制作3個平行。

2 結果與分析

2.1 半纖維素降解菌的篩選

經過平板分離,挑取能產生透明圈的菌株共6株。在液體培養基中發酵后測定酶活性,選出木聚糖酶活性較高的菌株3株,挑取酶活最高的菌株J-25進行產酶條件分析和酶學性質研究。菌株J-25在牛肉膏蛋白胨培養基上培養36 h后,菌落圓形,邊緣整齊,乳白色,凸起圓球狀,革蘭氏染色陽性,菌體形態為短桿狀,呈單個或成對排列。

2.2 菌株J-25生理生化鑒定

菌株J-25的V-P反應呈陰性,甲基紅實驗呈陽性,吲哚實驗呈弱陽性,糖發酵實驗中的葡萄糖、乳糖和蔗糖發酵實驗均呈陽性,即菌能分解三種糖產酸但不產氣,接觸酶陽性。

2.3 菌株J-25系統發育樹構建

將克隆得到的半纖維素降解菌株J-25的16S rDNA序列片段經過測序后,序列輸入NCBI數據庫中與已知的核酸序列進行Blast比對和相似性分析。結果表明,菌株J-25的16S rDNA序列與NCBI基因庫中纖維單胞菌屬(Cellulomonas)的16S rDNA同源性最為接近,且一致性均大于97%,表明該菌屬于Cellulomonas。通過CLustal X軟件的多序列比較和MEGA 6.0軟件的分析得到以16S rDNA序列為基礎構建的系統發育樹,見圖1。由系統發育樹表明,在以上15個菌株中,菌株J-25與Cellulomonassp. RP-3(EU303279)菌株同源性達99%以上,因此,命名為Cellulomonassp. J-25。

圖1 菌J-25與相近序列比較的系統發育進化樹Fig.1 The phylogenetic tree of J-25 and related sequences

2.4 菌株J-25產酶條件優化

2.4.1 培養時間對半纖維素酶產生的影響 通過將菌株J-25培養時間優化后,測定半纖維素降解酶活,其結果和數據分析見圖2。結果表明,J-25的酶活力在0～60 h逐漸增大,在60 h時達到最大為38.5 U/mL,其后酶活力隨著時間的增大而呈下降趨勢。所以確定最適發酵培養時間為60 h。

圖2 培養時間對發酵產酶的影響Fig.2 Effect of culture time on enzyme production

2.4.2 碳源及濃度對半纖維素酶產生的影響 以不同碳源為橫坐標,測得的酶活力為縱坐標,其結果見圖3。結果表明,碳源麥麩誘導產木聚糖酶的效果最好,達到40.6 U/mL;半纖維素次之,為38.1 U/mL;而其它單糖和多糖誘導效果較差。因此,選擇麥麩作為最適碳源。

圖3 碳源對產酶的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on production of enzymes

碳源則是由于原核生物必須根據環境條件的改變合成各種不同的蛋白質,使得代謝過程適應環境的變化,才能維持自己的生存和繁衍[15]。以不同濃度的麩皮為碳源發酵培養,其結果見圖4。麩皮濃度在5～20 g/L時,隨著濃度的增加,產酶活力逐漸增大,當濃度在20 g/L時,酶活力最高達到42.8 U/mL;在濃度高于20 g/L后,酶活力呈下降趨勢,當麩皮濃度達到一定濃度后,培養液混濁度升高,溶氧度降低所致。因此,最適麩皮濃度為20 g/L。

圖4 麩皮濃度對產酶的影響Fig.4 Effects of bran concentration on production of enzymes

2.4.3 氮源及濃度對半纖維素酶產生的影響 以不同氮源為橫坐標,氮源的質量濃度為5 g/L;碳源選擇麥麩(15 g/L),對菌株J-25進行發酵培養,其結果見圖5。結果表明,不同氮源對菌株J-25產酶活力有一定的影響,其中酵母粉對產酶活力影響最大,酶活力達到41.8 U/mL,硫酸銨次之,為40.2 U/mL;而硝酸銨效果最差,為28.3 U/mL。因此,選擇酵母粉作為最適碳源。以不同濃度的酵母粉為氮源發酵培養,其結果見圖6。酵母粉濃度在1.0～10 g/L時,隨著濃度的增加,產酶活力逐漸增大,當濃度在10 g/L時,酶活力最高達到43.6 U/mL;在濃度高于10 g/L后,酶活力呈略微下降趨勢,可能是當酵母粉濃度達到一定程度后,抑制了培養液的溶解氧的效率,導致產酶量降低。因此,最適酵母粉濃度為10 g/L。

圖5 氮源對產酶的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on production of enzymes

圖6 酵母粉濃度對產酶的影響Fig.6 Effects of yeast powder concentration on production of enzymes

2.4.4 初始pH對半纖維素酶產生的影響 培養基初始pH變化將會使微生物細胞原生質體膜上電荷隨之發生改變,從而影響微生物對培養基中營養物質的吸收及代謝產物的分泌,即影響了半纖維素酶的活性。如圖7所示,當初始pH在5.0～7.0時,酶活力隨著pH的升高而增大;在pH為7.0時,酶活力達到最大為45.8 U/mL;當pH高于7后,酶活力則隨pH的升高而減弱,表明偏酸或偏堿的環境均不適合產酶,故最適產酶pH為7.0。

圖7 初始pH對產酶的影響Fig.7 Effects of initial pH on production of enzymes

圖8 裝液量對產酶的影響Fig.8 Effects of loaded liquid on production of enzymes

2.4.5 培養基裝液量對半纖維素酶產生的影響 當搖瓶中裝液量較少時,通氣好,則菌體旺盛生長,但是過少的培養基不能滿足其生長產酶,因此酶活力較低;當裝液量過高時,影響通氣狀況從而影響菌的生長,導致產酶量發生變化。結果如圖8可知,當裝液量為10～50 mL時,隨著裝液量的增多,酶的活性逐漸增高,裝液量為50 mL時,產酶活力最高為48.6 U/mL;而裝液量高于50 mL后,產酶活性呈下降趨勢。故最裝液量為50 mL。

2.4.6 發酵溫度對半纖維素酶產生的影響 從酶反應動力學來看,發酵溫度升高,酶反應速率增大,生長代謝速度加快,但酶本身容易因過熱而失去活性,表現在菌體容易衰老,發酵周期縮短,影響最終產物。在發酵過程中,溫度對菌體的生長和酶的產生的影響是不同的[16]。如圖9所示,當溫度在20～30 ℃時,隨著發酵溫度升高,產酶活性也逐漸增大;當溫度達到32 ℃時,半纖維素酶活力達到最高為62.8 U/mL;溫度繼續升高反而使產酶活性快速減小。所以,最佳產酶溫度為30 ℃。

圖9 發酵培養溫度對產酶的影響Fig.9 Effects of fermentation temperature on production of enzymes

2.5 酶學特性研究

2.5.1 pH對酶反應的影響 pH變化會改變酶分子的空間構象,pH過大或過小將會導致酶喪失活性,進而使酶解率隨之降低。酶促反應在不同pH下,酶分子與底物分子中基團的解離狀態發生改變[17],從而影響酶分子的構象以及酶與底物的結合和催化效率。如圖10所示,當pH在5.5～6.5時,隨著pH增大酶活性增高,pH為6.5產酶活力達到最大為66.8 U/mL;之后隨著pH升高,產酶活力反而下降,可能pH升高抑制了酶的活性。因此,酶促反應最適pH為6.5。

圖10 pH對酶反應的影響Fig.10 Effects of pH on reaction of enzymes

2.5.2 溫度對酶反應的影響 溫度對酶的活性產生一定的影響,如圖11所示,當溫度過低時會抑制酶的活性,使得酶活力較低,隨著溫度升高,酶活力逐漸升高;當溫度升到溫度40 ℃時,酶的活性最大為63.8 U/mL。過高時,致使酶的空間結構破壞,酶活力反而下降。因此,酶促反應最適溫度為40 ℃。

圖11 發酵溫度對酶反應的影響Fig.11 Effects of temperature on reaction of enzymes

2.5.3 底物濃度對酶反應的影響 如圖12所示,底物濃度對酶反應的影響也很明顯,酶的活性先隨底物濃度的增加而增加,當到達15 g/L時達到最大為64.5 U/mL。在底物濃度較低的條件下,酶催化反應速度與底物濃度成正比,酶促反應速度將隨底物濃度的增加而變快,當酶量飽和時,酶活力則不再上升,當底物濃度過高時,反而酶的活性降低,因為產物對酶促反應有了抑制作用。由此可知,最適底物濃度為15 g/L。

圖12 底物濃度對酶反應的影響Fig.12 Effects of substrate concentration on reaction of enzymes

2.5.4 反應時間對酶反應的影響 隨著酶促反應的時間延長,酶的活性增大,但反應達到一定時間后,隨著時間的延長已不能有效地增加酶促反應活力。由于隨著時間的延長,酶分子已充分與底物接觸,結合后酶分子的有效濃度下降,且反應產物對酶促反應有一定的抑制作用,導致酶促反應變化并不明顯。由圖13所示,當30 min時,酶的活力最高為67.9 U/mL;而在隨著反應時間的延長,酶活力變化幾乎不大。因此,酶促反應最適時間為30 min。

圖13 時間對酶反應的影響Fig.13 Effects of time on reaction of enzymes

3 結論

篩選到一株半纖維素高效降解菌J-25,該菌株V-P反應呈陰性,甲基紅實驗呈陽性,吲哚實驗呈弱陽性,能分解葡萄糖、乳糖和蔗糖產酸但不產氣,鑒定為纖維單胞菌,命名為Cellulomonassp. J-25。半纖維素降解菌J-25的最佳產酶條件為:培養時間為60 h、溫度為30 ℃、麩皮濃度為20 g/L、酵母粉濃度為10 g/L、初始pH為7.0、裝液量為50 mL,在此培養條件下,酶的活性可達到62.8 U/mL。菌株J-25所產半纖維素酶的最適反應條件為:pH為6.5,溫度為40 ℃,底物濃度為15 g/L,反應時間為30 min。

國內對半纖維素降解菌定量分析報道還較少,一些研究學者只做了定性分析[18-19];張寧寧等[20]以溫泉水樣作為研究材料,分離嗜熱菌株DT-1的半纖維素酶活僅達到200 U/L;劉多濤等[21]以石油井附近的石油污染區域土樣,獲得菌株DT83半纖維素酶活可達70 U/mL以上;徐有權等[22]以田間富含腐爛稻稈的泥土為樣本,篩選獲得短小芽胞桿菌,產半纖維素酶活可達85.12 U/mL;而本實驗獲得的纖維單胞菌J-25,培養60 h后,其酶活性能夠達到62.8 U/mL,具有較高的降解半纖維活性。由于Cellulomonassp. J-25對半纖維的降解與菌株分泌的降解酶有關,因此,其降解途徑和機制還有待于進一步深入研究。本研究結果豐富了半纖維的生物降解資源庫,為進一步研究半纖維的生物降解提供了實驗依據。

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Screening,identification and enzymatic analysis of hemicellulose-degrading strain J-25

IANG Li-chun,WANG Cheng-hong,LIU Yu,LIN Shou-lu,ZHAO Li-ping,RUAN Qi-ping*

(Key Laboratory for Molecular Biology and Biopharmaceutics,Mianyang Normal University,Mianyang 621000，China)

A hemicellulose degrading bacteria was isolated with rotting wood as a source. Hydrolysis spot diameter measurement of hemicellulose plate and extracellular enzyme activity was used. The strain J-25 was identified asCellulomonasby 16S rDNA sequencing analysis,namedCellulomonassp. J-25. And characteristics of enzyme production and enzymatic properties were studied. The results indicated that fermentation conditions for enzyme production of strain J-25 was:temperature 30 ℃,the initial pH of 7.0,bran concentration of 20 g/L,yeast powder concentration of 10 g/L,liquid volume of 50 mL(250 mL flask),hemicellulose activity may reach 62.8 U/mL. The optimum enzyme reaction conditions were as follows:pH6.5,temperature of 40 ℃,substrate concentration of 15 g/mL,the reaction time of 30 min. These will provide experimental evidence for hemicellulose biodegradation.

hemicellulose;degrading-bacteria;fermentation conditions;enzymatic properties;16S rDNA

2016-09-28

姜立春(1977-)，男，博士，副教授，從事應用微生物學與分子生物學方面研究，E-mail:jiang_lichun @126.com。

*通訊作者:阮期平(1961-)，男，博士，教授，從事微生物學與生化藥學方面研究，E-mail: qpruan20141230@163.com。

四川省科技廳項目(2016JY0038)；四川省大學生創新創業訓練項目(201510639010,201510639066)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)05-0145-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.019