利心丸中防己諾林堿HPLC檢測方法的建立及其評價

白雪潔　于森　白雪媛

[摘要]目的建立利心丸中的防己諾林堿含量測定方法。方法采用高效液相色譜法，以Inertsil ODS-3（5um，4.6mm×250mm）色譜柱，甲醇一乙腈一水一二乙胺（52：20：28：0.08）為流動相，檢測波長：282nm，流速：1.0mL/min。結果己諾林堿在0.1617～0.9702ug的范圍內(nèi)線性關系良好，r=0.9996；平均加樣回收率是98.50%，RSD=1.26%。結論方法操作簡便，專屬性強，準確度高，可用于利心丸的質(zhì)量控制。

[關鍵詞]利心丸；防己諾林堿；HPLC

[中圖分類號]R284.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2017）03-57-04

利心丸（濃縮水丸）收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》第八冊，（標準編號為WS3-B-32）。由貂心、地黃、防己、茯苓、牡丹皮等八味中藥材制成的中藥復方制劑。具有養(yǎng)心安神的功效，臨床主要用于風濕性心臟病，心動過速，心律不齊，心力衰竭等而見心血不足等癥者。關于利心丸的質(zhì)量控制，原標準主要采用顯微和紫外分光光度法進行鑒別，方法過于簡單，無含量測定。相關文獻報道主要集中在牡丹皮中丹皮酚的含量測定及對地黃、防己和牡丹皮的TLC定性鑒別。本文在相關文獻的研究基礎上，參照《中國藥典》（2015版，一部）防己藥材含量測定方法，首次對利心丸（濃縮水丸）中防己諾林堿的含量采用高效液相色譜法進行分析，并建立了完整的質(zhì)量檢測方法。結果表明，本方法穩(wěn)定可靠、準確度高、重現(xiàn)性好。可通過定量檢測利心丸（濃縮水丸）中防己諾林堿的含量，有效控制其產(chǎn)品質(zhì)量。

1.儀器與試藥

安捷倫1 100型高效液相色譜儀；KQ-250型臺式超聲波處理器（上海右一儀器有限公司）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（廣州滬瑞明儀器有限公司）；101A系列電熱恒溫鼓風干燥箱（常州華冠儀器制造有限公司）；P225D型天平（北京賽多利斯）。

防己諾林堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110793-200605），利心丸（濃縮水丸）樣品，吉林特研藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號：20141201-20141205）；利心丸陰性樣品（自制）。甲醇、乙腈均為色譜純，水為純化水，其他試劑為分析純。

2.方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（5um，4.6mm×250mm）；流動相：甲醇一乙腈一水一二乙胺（52：20：28：0.08）；檢測波長：282nm；流速：1mL/min；柱溫：25℃；進樣量：10uL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備精密稱取防己諾林堿對照品5.39mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成53.9ug/mL的對照品溶液，備用。

2.2.2供試品溶液的制備取利心丸（濃縮水丸），研細，取約0.5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入2%鹽酸甲醇溶液50mL，稱定重量，回流提取30rain，放冷，再稱定重量，用2%鹽酸甲醇溶液補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液的制備取不含防己利心丸陰性樣品，按照利心丸（濃縮水丸）制備工藝制成缺防己的陰性樣品，再按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法，制成陰性對照溶液。

2.2.4專屬性考察分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液陰性對照溶液（20、10、20uL）注入液相色譜儀中，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果表明，本方法具有良好的專屬性。色譜圖見圖1。

2.3線性關系考察

精密吸取2.2.1項下的防己諾林堿對照品3、6、9、12、15、18uL注入液相色譜儀進行測定。以防己諾林堿進樣量（ug）為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，計算回歸方程為：Y=824.64X-1.463，r=0.9996。結果表明：防己諾林堿進樣量在0.1617～0.9702ug范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

2.4中間精密度試驗

取同一批利心丸樣品（批號：20141203）適量，共6份，精密稱定，分別按照“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，在同一實驗室內(nèi)，不同時間，由不同分析人員在不同的設備上進行6次獨立測定，以測定結果的相對標準偏差反映實驗方法的精密度。測定結果表明，防己諾林堿的平均含量是55.58ug，g，RSD是1.94%（n=6），該方法中間精密度良好。

2.5重復性試驗

取同一批利心丸樣品（批號：20141203）6份，精密稱定，分別按照“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，在相同條件下，由同一分析人員在較短的間隔時間內(nèi)按照“2.1”項下色譜條件進行6次獨立測定，計算防己諾林堿的含量，以測定結果的相對標準偏差反映該測定方法的重復性。結果表明，樣品中防己諾林堿含量為55.08ug/g，RSD為1.43%（n=6）。表明本方法重復性良好。

2.6準確度試驗

精密稱取利心丸樣品6份（批號：20141203，防己諾林堿含量為55.08ug/g）各約0.25g，置于圓底燒瓶中，精密加入濃度為1.204ug，mL防己諾林堿對照品溶液1.0mL，按“2.2.2”項下方法操作，制備供試品溶液，按上述色譜條件測定。實驗結果見表1。

2.7樣品含量測定

取利心丸樣品各0.5g，精密稱定，進行測定，計算防己諾林堿的含量，結果見表2。

2.8耐用性買驗

2.8.1供試液穩(wěn)定性及儀器精密度實驗取同一供試品溶液（批號：20141203）適量，按2.1”項下色譜條件不同時間重復進樣測定6次，以測定結果的相對標準偏差（RSD）來反映測定儀器的精密度及供試液的穩(wěn)定性，結果見表3。根據(jù)上述測定結果可知，供試液在8h內(nèi)穩(wěn)定，且儀器精密度良好。

2.8.2柱溫對測定結果的影響按供試品溶液制備方法制備樣品液，按選定色譜條件分別于柱溫30℃、35℃、40℃進樣測定，結果表明柱溫變化對分離效果及測定結果略有影響，但差異不大。

2.8.3不同品牌色譜柱按選定色譜條件分別采用三種色譜柱ZORBAX SB-Aq柱、Apollo C₁₈柱、Inertsil ODS-3色譜柱，進樣測定。結果表明，Inertsil ODS-3色譜柱分離效果最好，故選用InertsilODS-3色譜柱。

3.討論

3.1目標成分的選擇

關于利心丸的質(zhì)量研究，文獻報道主要集中在丹皮酚的含量測定及對地黃、防己和牡丹皮的TLC定性鑒別。本文通過系統(tǒng)的比較研究，首次建立防己諾林堿的含量檢測方法，是對利心丸原有質(zhì)量標準的必要補充，對指導制劑生產(chǎn)和控制產(chǎn)品質(zhì)量具有一定的現(xiàn)實意義。

3.2色譜分離條件的選擇

流動相的選擇，2015年版中國藥典防己藥材中防己諾林堿的測定方法，需要用冰醋酸調(diào)節(jié)pH-值，流動相中還使用了十二烷基磺酸鈉，色譜條件較復雜。有文獻報道應用乙腈一甲醇一水一三乙胺作為流動相可對防己藥材中的防己諾林堿進行良好的分離。本實驗分別考查了甲醇一0.5%二乙胺、甲醇1%二乙胺、乙腈-0.5%二乙胺、乙腈-1%二乙胺等不同流動相及不同比例，最后確定甲醇一乙腈一水一二乙胺（52：20：28：0.08）為流動相，色譜條件比較簡單，分析圖譜的分離度、拖尾因子及對稱性等條件均達到《藥典》中的要求。本研究所建立的HPLC法可以使防己諾林堿與利心丸中的其他成分達到基線分離，分析時間短，結果準確，可靠。

3.3樣品提取方法的選擇

本研究對利心丸不同的提取方法，索氏提取、水浴回流法和超聲提取法進行了比較，并對不同的提取時間，20、30、40min進行比較。最終優(yōu)選2%鹽酸甲醇溶液，加熱回流提取30min，作為樣品的提取方法。

本方法操作簡便，專屬性強，準確度高，可用于利心丸中防己諾林堿的定量分析方法，為進一步制定利心丸質(zhì)量標準提供依據(jù)。