茉莉酸甲酯對藜感染黃瓜花葉病毒后的生理影響

夏明星 于曉云 陳偉

摘要 [目的]探究茉莉酸甲酯（MeJA）對黃瓜花葉病毒介導藜的抗病生理反應的影響。[方法]采用MeJA及其抑制劑沒食子酸丙酯（PG）預處理藜葉片后，分別接種黃瓜花葉病毒（CMV），并于接種0、1、3、5、7、9 d后測定其葉中H2O2質(zhì)量分數(shù)、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性等生理指標的變化。[結果]與對照相比，MeJA處理的接種藜葉POD活性前期降低，中后期逐漸升高，CAT、SOD活力與POD相反。接種CMV后，MeJA能提高相關抗氧化物酶的活性，其抑制劑PG處理后對MeJA所調(diào)控的氧化酶活性具有一定的抑制作用。[結論]MeJA對藜抗CMV有一定的促進作用。

關鍵詞 茉莉酸甲酯；沒食子酸丙酯；藜；CMV病毒

中圖分類號 S432.2+2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）28-0154-04

Abstract [Objective]The aim was to find out the effect of Methyl jasmonate （MeJA） on Cucumber mosaic virus （CMV）mediated physiological responses in Chenopodium album.[Method]The leaves of Chenopodium album were pretreated with either MeJA or its inhibitor gallic acid propyl gallate （PG）， and then were infected by CMV for 0， 1， 3， 5， 7 and 9 d. After collecting the leaves samples， the contents of H2O2 content and activities of the antioxidant enzymes including CAT， SOD and POD activity were determined.[Result]Compared to controls， POD activity was suppressed by MeJA pretreatment at the beginning， and went up gradually afterwards，while CAT and SOD activity in contrast to the POD. Furthermore， after inoculation with CMV， activities of the antioxidant enzymes pretreated with MeJA were significantly enhanced， whereas they were suppressed as pretreated with the inhibitor PG. [Conclusion]MeJA plays positive role in physiological resistance of Chenopodium album against CMV.

Key words Methyl jasmonate；Propyl gallate；Chenopodium album；Cucumber mosaic virus

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，簡稱CMV）是世界上流行的植物病毒之一，其侵染寄主廣泛，因而也是目前研究較多的具經(jīng)濟重要性的植物病毒之一，其發(fā)生程度與蚜蟲繁殖情況密切相關。目前生產(chǎn)上大多通過防治蚜蟲來達到防治CMV的目的，而現(xiàn)有的防蚜蟲方式主要為化學防治，化學藥劑在長期的使用過程中其“3R”問題越來越被人重視。為解決上述問題，植物誘導抗病性被提了出來，Kloepper將誘導抗病性定義為“由生物或非生物因子激活的、依賴于寄主植物的物理或化學屏障的活化抗性過程”[1-2]。研究表明，茉莉酸（JA）及其衍生物、乙烯（ETH）、水楊酸（SA）等能有效誘發(fā)植物系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）[3]。茉莉酸甲酯（MeJA）是高等植物體內(nèi)的內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，對植物生長發(fā)育具有極為重要的生理作用[4]。MeJA易揮發(fā)，可從植物的氣孔進入植物體內(nèi)，于細胞質(zhì)中被酯酶水解為茉莉酸，實現(xiàn)長距離信號傳導和植物間的交流，致使鄰近植物產(chǎn)生誘導防御反應[5]。目前已有大量研究表明，外源施用MeJA可誘導植物防衛(wèi)基因的表達、相關防御酶活性增強及多種次生代謝物質(zhì)的合成等，并能增強植物對病原菌的抗性[6-7]。沒食子酸丙酯（PG）是一種來源于綠色植物的天然多酚類化合物，也是一種極為重要的沒食子酸衍生物[8]。研究表明，亞麻酸通過脂氧合酶（LOX）、丙二烯氧化物合成酶（AOS）等一系列酶促反應生成JA與MeJA[9]，而PG是LOX脂氧合酶的抑制劑，通過抑制LOX活性而有效抑制JA合成途徑[10]。

筆者以植物病毒的指示植物——藜為材料，研究了MeJA及其抑制劑PG對藜感染黃瓜花葉病毒后生理反應的影響，以期探究茉莉酸甲酯與CMV病毒及藜抗病毒機制間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

藜（Chenopodium album）從四川農(nóng)業(yè)大學成都校區(qū)校園田間移栽獲得，所選材料均為高約30 cm、大小均勻、長勢一致的植株。黃瓜花葉病毒由四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物病理實驗室提供。

1.2 試驗前處理

以200 μmol/L MeJA與1 mmol/L PG溶液分別噴施整株，以噴施蒸餾水的處理為對照，之后放于透明密閉的裝置中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，以2種方式處理植株葉片，第1種方式是采用摩擦接種方式接種CMV病毒，每株接種4～7片葉；第2種是僅摩擦葉片但不接種CMV病毒，每株處理4～7片葉作為模擬接種對照，設3次重復。接種后，每天觀察植株的發(fā)病情況，直至發(fā)病葉片脫落為止，并做詳細記錄。

1.3 生理指標的測定

分別于接種后0、1、3、5、7、9 d摘取經(jīng)上述處理葉片測定以下幾個指標：過氧化氫（H2O2）含量、過氧化氫酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性。按Velikova等[11]的方法測定H2O2含量，參照結合Beers等[12]和Patra等[13]方法測定CAT活性，用NBT光還原法測定SOD活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007對試驗進行分析，應用SPSS 17.0進行差異顯著性和相關性分析。對不同溶劑處理下藜的各項生理指標進行單因素方差分析，結果用“平均數(shù)±標準誤差”表示，單因素方差分析后做多重比較。

2 結果與分析

2.1 藜接種CMV后的表型變化

接種5 d后，經(jīng)MeJA處理的接種葉開始變黃且有芝麻粒大小的枯斑出現(xiàn)，而經(jīng)PG和蒸餾水處理的接種葉7 d后才表現(xiàn)出相同癥狀；經(jīng)MeJA、PG、蒸餾水處理的接種葉片出現(xiàn)花葉的時間依次為10、8、9 d，葉片經(jīng)PG處理出現(xiàn)花葉的時間較蒸餾水處理的時間提前，而MeJA處理后藜葉片出現(xiàn)花葉的時間比蒸餾水處理延后。

經(jīng)MeJA溶液、PG溶液和蒸餾水處理的植株出現(xiàn)枯斑的時間存在一定差異，其原因可能是因為受CMV侵染后，植物細胞快速死亡，植株產(chǎn)生了超敏反應，MeJA能夠促進超敏反應，所以出現(xiàn)枯斑的時間比其他2種處理更快，由于MeJA處理產(chǎn)生的超敏反應更早，導致病原菌擴展變慢，植株發(fā)病時間推遲，而PG抑制了JA途徑，導致植株發(fā)病時間提前。

2.2 MeJA對藜幾個生理指標的影響

2.2.1 噴施MeJA后藜接種CMV葉中H2O2質(zhì)量分數(shù)及CAT活性變化。

從圖1可以看出，經(jīng)MeJA處理后模擬接種的葉片和蒸餾水處理的接種葉片CAT活性變化基本一致，總體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢；而經(jīng)MeJA處理的葉片CAT活性較其他2組處理提前到1 d達到最大值，其可能的原因是：外源噴施的MeJA可誘導植株體內(nèi)相關細胞或組織啟動防御機制，因此可以對病原菌的侵染較蒸餾水、PG處理葉片提前做出應答。

從圖2可以看出，經(jīng)MeJA處理后接種的葉片體內(nèi)H2O2呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，并在整個檢測過程中出現(xiàn)了2次峰值，而經(jīng)過蒸餾水處理后接種CMV和MeJA處理后模擬接種的2組處理的H2O2變化情況基本一致，只在接種后第9天有差異。

經(jīng)MeJA處理接種的葉片CAT活性在0～1 d升高，1～3 d降低，而H2O2 質(zhì)量分數(shù)在0～3 d逐漸升高，可能是因為MeJA的處理導致了植物體內(nèi)本身積累了一定量的H2O2，雖然CAT活性在接種后1～3 d降低，但其降低速度低于之前升高速度，故植物體內(nèi)H2O2質(zhì)量分數(shù)在接種后1～3 d在緩慢增加。3種處理的H2O2都是先增加到頂峰，隨后逐漸降低，MeJA處理的接種葉較蒸餾水處理的接種葉和MeJA處理模擬接種葉先達到峰值，這可能是因為經(jīng)MeJA處理后接種CMV的藜葉片內(nèi)CAT活性較其他2個處理先降低到最低值；而后期在CAT活性基本不變的情況下H2O2的質(zhì)量分數(shù)逐漸增加，其可能的原因是MeJA啟動的衰老程序中產(chǎn)生了較多的H2O2，這可能與藜較早產(chǎn)生超敏反應有關。

2.2.2 噴施MeJA后藜接種CMV葉中SOD活性的變化情況。經(jīng)研究，SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，可對抗與阻斷超氧陰離子自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞。由圖3可知，前期SOD活性增加速度由高到低依次為MeJA處理組、MeJA模擬接種處理組、蒸餾水處理組，這可能是因為MeJA能夠快速誘導植物體內(nèi)產(chǎn)生抗性，以增加SOD活性來修復因病毒侵染而對細胞造成的損害。因為SOD強大的修復功能，植株細胞因侵染和摩擦的損害都在不斷的愈合[14]，所以在中期其活性變化不會太大。MeJA模擬接種處理SOD在7 d出現(xiàn)了峰值，很有可能是模擬接種時植物摩擦受傷，從而誘導了內(nèi)源JA所調(diào)控的過程，進而增加自身對機械損傷的抗性。

2.2.3 噴施MeJA后藜接種CMV葉中POD活性的變化情況。

POD不僅參與植物體內(nèi)木質(zhì)素的聚合過程，也是細胞內(nèi)重要的內(nèi)源活性清除劑，故POD活性與植物抗病性有密切的關系[15]。湯會君等[16]研究表明，煙草接種病毒后抗病品種POD活性升高。由圖4可以看出，3個處理POD活性變化趨勢相似均呈現(xiàn)先下降后上升又下降的趨勢，所不同的是MeJA模擬接種處理組恢復上升最早，于第3天恢復到較高水平，并保持到第5天；MeJA接種處理組次之，于第5天恢復到最大值；蒸餾水處理組則在第7天。可以推測MeJA能促使植株產(chǎn)生對CMV的抗性。

2.3 PG對藜幾個生理指標的影響

2.3.1 噴施PG后藜接種CMV葉中H2O2質(zhì)量分數(shù)及CAT活性的變化情況。

在逆境脅迫下，細胞內(nèi)易產(chǎn)生H2O2破壞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，而CAT能把H2O2分解，從而清除H2O2維護膜的穩(wěn)定性，就抗逆性強的品種來說過氧化氫酶活性與抗逆性呈顯著性相關。由圖5、6可知，H2O2質(zhì)量分數(shù)變化并沒有同其相應CAT的變化呈一定的相關性，其可能的原因是影響CAT活性的因素有很多，PG與JA的作用時期也是其中之一，故PG與CAT這2種生理指標不一定有直接聯(lián)系。在前期經(jīng)PG處理的H2O2質(zhì)量分數(shù)在緩慢下降，與圖2各處理前期的變化相反，很有可能是PG抑制了植物體內(nèi)MeJA所誘導的超敏反應的產(chǎn)生，從而降低了植物對病毒與受傷的防御反應能力。

2.3.2 噴施PG后藜接種CMV葉中SOD活性的變化情況。

由圖7可以看出，經(jīng)PG處理的接種葉片SOD活性與PG處理的模擬接種葉片SOD活性變化趨勢恰恰相反，這很有可能是因為在接種CMV后，0～1 d時經(jīng)PG處理的植株被病毒侵染激發(fā)體內(nèi)防御機制，使能夠修復損害細胞的SOD活性增強，而PG模擬接種組并未實際接種CMV病毒，所以SOD活性未增加；在接種后1～3 d模擬組SOD活性開始增加，可能是因為之前摩擦對植物細胞造成了損傷，致使植物開始自動修復。接種CMV的蒸餾水處理組SOD活性在200 U/g小幅度波動，沒有明顯變化，可能是采樣葉片在接種病毒時摩擦得不夠，既未對植物葉片造成傷害，也未能將病毒成功接種于植物體內(nèi)，故在植株正常生長過程中，SOD活性無太大變化。

2.3.3 噴施PG后藜接種CMV葉中POD活性的變化情況。從圖8可以看出，3個處理組POD活性變化趨勢基本一致，均呈現(xiàn)出先下降后升高至峰值然后再降低的變化趨勢只是出現(xiàn)峰值的時間點不同。其中，PG處理后模擬接種的葉片POD酶活力始終低于初始酶活力，而經(jīng)PG處理和蒸餾水處理后接種CMV的葉片POD酶活力最大值高于初始酶活力，下降后的回升均出現(xiàn)在第7天。與圖4相比，經(jīng)PG處理的接種CMV葉片的POD活性回升較經(jīng)MeJA處理的接種CMV葉片推遲2 d，而經(jīng)PG處理的模擬接種葉片的POD活性則無回升趨勢，故推測PG可能抑制了MeJA所調(diào)控的POD活性上升過程。研究表明，接種病毒后抗病品種植物的POD會升高，而此處PG抑制了植物產(chǎn)生抗性反應[15]。

3 討論與結論

研究表明，MeJA不僅能有效調(diào)控植物的生長發(fā)育，且在植物脅迫防御中也有重要作用[17]，增強植物抵御不良環(huán)境的能力[18]。當植株受到外界脅迫時，體內(nèi)的SOD活性會明顯增強，以提高其自身的抗氧化能力和抗病性[15]。禹艷紅等[19]研究表明，MeJA能提高巴西煙草對CMV的抗性，且指出SOD活性與抗病毒有較密切的關系。該試驗中，經(jīng)MeJA處理的藜接種葉SOD活性比空白對照組高，而PG處理的藜接種葉SOD活性在0～1 d升高，1～3 d降低，但總體低于MeJA處理組，表明MeJA能有效提高植株藜體內(nèi)的SOD活性。

POD不僅是木質(zhì)素合成的關鍵酶之一，而且還參與氧自由基的消除反應和乙烯生物合成，同植物的抗病性密切相關[20]。該試驗中，MeJA處理的接種藜葉POD活性前期降低直到低于對照，中后期逐漸升高，且高于對照，這與師金鴿等[21]的試驗結果相同。

H2O2作為植物對外界環(huán)境脅迫反應的調(diào)節(jié)因子，除了能直接殺死病原物外，還可選擇性誘導許多相關基因的表達，以提高其自身免疫能力。該研究表明，經(jīng)MeJA處理的藜接種葉在接種后0～3 d其CAT活性先升高后降低，而相對應的H2O2質(zhì)量分數(shù)也隨之升高，這同師金鴿等[17]的試驗結果相符。經(jīng)PG處理的接種藜葉0～3 d先升高后降低，其相對應H2O2質(zhì)量分數(shù)則一直在降低。何強等[8]研究表明，PG作為MeJA的抑制劑，能與蛋白質(zhì)結合抑制某些氧化酶的活性，所以PG可能是抑制了植物體內(nèi)MeJA的形成，導致H2O2質(zhì)量分數(shù)降低，從而抑制植株的抗病性。

綜上所述，藜接種CMV后MeJA能提高相關氧化酶的活性，其抑制劑PG處理后對MeJA所調(diào)控的氧化酶活性變化過程則有一定的抑制作用，故MeJA對藜抗CMV有一定的促進作用。

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