第二代高通量測序技術用于進口細菌型微生物肥料菌群分析

劉玉莉 魏霜 劉碧琳

摘要 [目的]分析細菌型微生物肥料菌群結構。[方法]采用第二代高通量測序技術對細菌型微生物肥料菌群結構進行分析。[結果]產品中測序出的111個OUT具體分屬于24個屬的細菌，其中共有21個OUT鑒定到種；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）占菌群的主要位置，分別是96.29%和0.66%，其他菌占3.05%；該樣品中含有假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），這提示樣品中可能含有植物病原細菌。[結論]將第二代高通量測序技術用于微生物肥料菌群分析，為進出口微生物肥料產品的快速分析提供了一種方法。

關鍵詞 第二代高通量測序；微生物肥料；菌群

中圖分類號 S144 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）28-0146-02

Abstract [Objective]To study the bacterial community structure of import microbial fertilizers.[Method]Next generation sequencing technique was used to analyze the bacterial community structure of import microbial fertilizers.[Result] 111 OUTs were identified as 24 genus. Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis accounted for 96.29% and 0.66%， and the other bacteria accounted for 3.05%.Pseudomonas sp. has been found which means plant pathogenic bacteria may contain in this product.[Conclusion]Next generation sequencing technique has been developed for analyzing the bacterial community structure of microbial fertilizers， which can be used for the import or export of microbial fertilizers.

Key words Next generation sequencing technique；Microbial fertilizers；Bacterial community

菌型微生物肥料是一類益生菌制劑產品，它不僅可以促進植物生長，提高產量，而且能夠解決因長期施用化肥而造成的一系列生態環境問題，在綠色有機食品生產、農業生態環境保護以及高產、優質、高效農業的持續發展中發揮著重要作用[1-3]。通常而言，細菌型微生物肥料被認為是一個小型的微生物群落，液態微生物菌劑肥料在生產、運輸、儲存等過程中容易受到雜菌污染，具有攜帶有毒害或潛在危害的病原菌的風險，施用于農作物上可能引起作物病害，同時人畜食用后會受到病原微生物的威脅。

當進出口微生物肥料產品的批次數量較大時，采用傳統分離培養方法工作量太大，因而研發快速、高通量的微生物肥料產品菌群分析技術具有重要意義。目前，微生物肥料群落分析已有少量報道，李朔[4]利用PCR-DGGE指紋圖譜技術研究了微生物肥料生產培養過程中菌群的變化；李武等[5]、張曉君等[6]利用PCR-DGGE指紋圖譜技術對同一生產批次3個不同包裝樣品的細菌和真菌群落進行分析，建立了對微生物肥料質量進行評估和檢測的方法。但是，這些學者分析的關鍵點主要集中在微生物肥料生產過程中菌群的變化。另一方面，這些學者采用PCR-DGGE技術進行分析，該技術操作起來非常復雜，耗時耗力?？傊暗难芯坎荒軡M足口岸實驗室對微生物肥料進行符合性驗證快速初篩的要求。

該研究擬采用第二代高通量測序（454測序）技術對進口細菌型微生物肥料進行群落結構分析，旨在建立一套準確分析細菌型微生物肥料菌落結構的技術方案。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用樣品為進口液體微生物肥料，自廣東汕頭國際集裝箱碼頭進口，來源于美國，隨機采一個批次的產品作為試驗樣品（2015年11月進口），該產品標注主要成分為乳桿菌。

1.2 第二代高通量測序法

由中國檢驗檢疫科學研究院進行第二代高通量測序（454測序），具體操作流程如下。

1.2.1 PCR擴增。

對細菌16S rRNA基因的V1～V3區域進行擴增，合成帶有5454 A、B接頭-特異引物3的融合引物。其中通用引物為27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；533R：TTACCGCGGCTGCTGGCAC。

PCR擴增條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃復性30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每個樣品3個重復，將同一樣品的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收PCR產物。

1.2.2 油包水PCR （emPCR）。

該過程一般分為4步：DNA片段和捕獲磁珠混合；礦物油和水相的劇烈振蕩產生油包水環境；DNA片段在油包水環境中擴增；破油并富集有效擴增磁珠。

1.2.3 454測序。

454測序主要步驟如下：PTP板準備和清洗；富集磁珠涂布于PTP板；涂布其他反應成分和包埋磁珠；PTP板置于儀器開始測序。

1.2.4 生物信息分析。

1.2.4.1 數據去雜。對測序端前引物進行錯配檢查，保留引物的錯配數在2個以內的序列；測序時隨序列增長堿基質量會降低，檢測序列3端引物和接頭，若能檢測到且匹配度在95%以上，則認為接頭和引物之前的目標區域序列可靠性較高，同時從3 端引物處修剪除去尾部序列，對于無法檢測到3端引物和接頭的序列，即未測通目標區域的序列，若達到一定長度，則修剪去除末端低質量堿基，從而保留更多的序列信息；去除模糊堿基 （ambiguous） 數大于0、單堿基高重復區 （homologous）大于6以及長度小于200 bp的序列。

1.2.4.2 OTU （Operational Taxonomic Units，操作分類單元） 聚類分析。在97%的相似水平下，應用QIIME軟件中Usearch對所有序列進行OTU劃分。

1.2.4.3 分類學分析。為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，選用Silva （Release115 http：//www.arb-silva.de）數據庫進行比對。

1.2.4.4 多樣性指數 （Alphadiversity） 計算。在97% （0.97） 的相似水平下，采用Mothur軟件（version v.1.30.1 http：//www.mothur. org/wiki/Schloss_ SOPAlpha_ diversity）計算菌群豐度指數（Ace、Chao1）以及菌群多樣性指數（Shannon、Simpson指數）。

2 結果與分析

2.1 16S rRNA基因 V1～V3區域擴增結果

對樣本基因組DNA進行16S rRNA基因V1～V3區擴增，均得到500 bp左右大小的條帶，與目的片段大小一致，且條帶單一，可用于后續測序試驗 （圖1）。

2.2 細菌群落組成分析

該樣品共獲得116 789條有效序列，有效序列經過進一步去雜和修剪后得到116 751條優化序列，優化序列比例為99.967 4%。經處理共獲得111個OUT，Ace指數為163，Chao1指數為175，Shannon指數為0.369，Simpson指數為0.071 9。經比對這111個OUT具體分屬于5個門、6個綱、11個目、19個科、24個屬的細菌，其中共有21個OUT鑒定到種。按照屬級別進行分析，乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、梭菌屬（Clostridium）這3個屬在菌群中占主要地位，分別占97.72%、0.99%、0.62%，其他細菌占0.67%。按照種級別來進行分析的話，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）占菌群的主要位置，分別是96.29%和0.66%，其他菌占3.05%。

該樣品鑒定出來的乳桿菌屬（Lactobacillus）菌株共有7種，分別是Lactobacillus fabifermentans、Lactobacillus faeni、Lactobacillus mobilis、Lactobacillus satsumensis、副干酪乳桿菌亞種Lactobacillus paracasei subsp. paracasei、短乳桿菌Lactobacillus brevis、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，其中植物乳桿菌占主要成分，另外還分析到樣品中含有乳球菌屬（Lactococcus），這類也經常作為益生菌添加到各類益生菌產品中。相比其他類別菌株，產品中鑒定出的乳桿菌種類是最多的，這與產品標識一致。

該樣品中含有假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），在《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中，屬于假單胞菌屬的檢疫性有害生物共有6種，它們分別是菜豆暈疫病菌[Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola （Burkholder） Gardan et al.]、核果樹潰瘍病菌[Pseudomonas syringae pv. morsprunorum （Wormald ） Young et al.]、桃樹潰瘍病菌[Pseudomonas syringae pv. persicae （Prunier et al. ） Young et al.]、豌豆細菌性疫病菌[Pseudomonas syringae pv. pisi （Sackett） Young et al.]、十字花科黑斑病菌[Pseudomonas syringae pv. maculicola （McCulloch） Young et al.]、番茄細菌性葉斑病菌[Pseudomonas syringae pv. tomato （Okabe） Young et al.]，這提示人們應該對該產品的這些菌重點關注，另外還有的假單胞菌屬的一些菌為食源性病原菌，例如綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa），但值得注意的是，假單胞菌屬也有一些有益菌，例如施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）常作為固氮菌添加到微生物肥料產品中，同時也有研究將其用于石油降解應用中。另外，該產品中還含有其他一些可能有害的菌，例如產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、鶉雞腸球菌（Enterococcus gallinarum）、雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri），產氣腸桿菌是人類和動物腸道的正常菌群，為人體內的正常菌相，但在人體虛弱的特殊情況下可能會引起疾??；鶉雞腸球菌是禽類腸道的正常菌群，但其在機體免疫力低下時可入侵血液引發敗血癥；已有報道稱雷氏普羅威登斯菌能引起食物中毒，同時該菌也是一種對蝦病原菌?？偟膩砜?，這些有害菌在該微生物肥料產品中占的比例很小，造成危害的可能性不大。

3 結論與討論

該研究采用第二代高通量測序法對一款細菌型微生物肥料產品的菌群進行分析，結果顯示植物乳桿菌占該款產品菌群的96.29%，并且可能含有多種潛在危害植物、動物、人類的病原菌，該結果提示人們應該對這款產品的這些類別菌提高關注，值得注意的是，該產品這些有害菌占的比例非常低，風險不大，應針對不同批次產品進行檢測，實時監控這些有害菌在不同批次產品中的變化，以綜合評估產品風險。

參考文獻

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[6] 張曉君，馮清平.分子生態學方法在微生物多樣性研究中的應用[J].微生物學通報，1999，26（1）：68-70.