大腸桿菌Ⅱ型丙酮酸激酶的表達·純化及鑒定

趙龍 周賢軒

摘要 [目的]獲得大腸桿菌的 Ⅱ 型丙酮酸激酶。[方法]首先用MEGA7軟件對不同生物丙酮酸激酶的編碼基因進行聚類分析；通過聚合酶鏈式反應（PCR）擴增了大腸桿菌的 Ⅱ 型丙酮酸激酶基因pykA，將其克隆到pET28a載體中，構建了重組質粒載體pET28a-pykA并在大腸桿菌BL21中實現了 Ⅱ 型丙酮酸激酶（PykA）的高效表達；利用鎳柱親和層析系統純化了PykA蛋白，并進行了高效液相色譜（HPLC）檢測。[結果]聚類分析結果表明，大腸桿菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶與其他原核生物的丙酮酸激酶氨基酸序列具有高度同源性。HPLC檢測發現Ⅱ型丙酮酸激酶PykA在體外可以高效地將ADP轉化為ATP。[結論]該研究獲得了 Ⅱ 型丙酮酸激酶，為ATP的合成以及 Ⅱ 型丙酮酸激酶為基礎的ATP再生系統的研究提供了參考。

關鍵詞 Ⅱ 型丙酮酸激酶；蛋白表達；高效液相色譜；大腸桿菌；ATP再生系統

中圖分類號 Q786 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）25-0142-03

Abstract [Objective] The aim was to obtain the type Ⅱ pyruvate kinase of E.coli.[Method] The phylogenetic analysis using MEGA7 software showed high similarity between the a mino acid sequence of type Ⅱ pyruvate kinase in Escherichia coli and that of other bacteria.Then，the pykA gene encoding type Ⅱ pyruvate kinase of E.coli was amplified by using Polymerase Chain Reaction （PCR），cloned into the pET28a vector，and overexpressed in the host strain E.coli BL21.The resultant product was purified by nickel affinity chromatography，and detected by high performance liquid chromatography （HPLC）.[Result] HPLC analysis revealed that PykA efficiently converted ADP to ATP in vitro.[Conclusion] The progress in expression，purification and activity deter mination of type Ⅱ pyruvate kinase will contribute to ATP production and biosynthesis based on the ATP regeneration system.

Key words Pyruvate kinase Ⅱ；Protein expression；High performance liquid chromatography；Escherichia coli；ATP regeneration system

丙酮酸激酶廣泛分布于微生物、動物和植物體內，是糖酵解途徑重要的變構調節酶，參與了糖酵解途徑的底物水平磷酸化反應[1]。丙酮酸激酶的國際酶學編號為EC2.7.1.40，又稱為磷酸丙酮酸激酶、丙酮酸磷轉移酶，該酶在同一個有機體中存在多種同工酶[2]。在細菌中通常有2種丙酮酸激酶，即 Ⅰ 型PykF丙酮酸激酶和 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA。丙酮酸激酶能夠催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基團轉移到二磷酸腺苷（ADP）上從而生成三磷酸腺苷（ATP）和丙酮酸（PYR）[3]。ATP的合成與再生在工業生產與科學研究工作中有重要價值。丙酮酸激酶催化的ADP磷酸化生成ATP，可實現ATP的酶學方法合成以及生物合成系統中的ATP再生[4]。同時，以PEP為磷酸基團供體，丙酮酸激酶催化的核糖核苷三磷酸再生系統同樣適用于其他5′-三磷酸核苷酸、6-磷酸葡萄糖及各種堿和糖修飾的核苷類似物的合成[5]。在6-磷酸葡萄糖的合成過程中，丙酮酸激酶生成的ATP作為底物被己糖激酶利用，將磷酸基團轉移到葡萄糖上，生成6-磷酸葡萄糖和ADP。該反應中的副產物ADP又可以反復被丙酮酸激酶利用，作為底物重新催化再生合成ATP，從而形成了ADP與ATP相互轉化的循環，不僅節約成本，還使反應更加高效[5]。

據報道，不同的NDP作為反應底物，在丙酮酸激酶催化的反應中動力學常數往往不同[6]。大腸桿菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA對不同的NDP的催化效率由大到小依次為ADP、GDP、CDP、UDP，其中ADP是該酶的最適底物[7]。大腸桿菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA與大腸桿菌 I 型丙酮酸激酶PykF相比，前者對ADP的催化效率比后者高出3倍。因此，相對于PykF來說，在催化ADP磷酸化的ATP酶法合成與ATP再生系統中，Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA是更好的選擇。筆者克隆、表達并純化了大腸桿菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA，以期為獲得高純度 Ⅱ 型丙酮酸激酶以及將其應用于ATP合成與ATP再生系統等研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

表達載體pET28a由合肥工業大學生物與食品工程學院保存；大腸桿菌菌株DH5α、BL21（DE3）、TOP10購自Invitrogen公司；限制性內切酶Xho Ⅰ、BamH Ⅰ、Bgl Ⅱ、堿性磷酸酶（CIAP）、高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶、DNA連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver 2.1購自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；SanPrep柱式質粒DNA提取試劑盒、SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、Bradford法蛋白濃度測定試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 聚類分析。

在NCBI數據庫中檢索丙酮酸激酶并獲得相應的丙酮酸激酶氨基酸序列。這些序列包括了17個細菌、真菌及多細胞生物的丙酮酸激酶氨基酸序列。通過MEGA7軟件，分析了丙酮酸激酶氨基酸序列的同源性，并進行聚類制圖。

1.2.2 pET28a-pykA的構建。

根據大腸桿菌pykA基因（GenBank編號為NZ_CP017979）編碼區的DNA序列上、下游為同源臂設計擴增引物，上、下游引物分別為5′-CCGCGGATCCATGTCCAGAAGGCTTCGCAG-3′和5′-CCCGCTCGA GTTACTCTACCGTTAAAATACGCGTG-3′。引物兩端引入了限制性酶切位點Xho Ⅰ與BamH Ⅰ。通過聚合物鏈式反應（PCR），以大腸桿菌基因組DNA為模板擴增pykA基因，反應使用高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶，反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環；72 ℃總延伸10 min。PCR產物經PCR產物純化試劑盒純化后，利用限制性內切酶Xho Ⅰ與BamH Ⅰ進行酶切消化，與表達載體pET28a連接，轉化TOP10感受態細胞，利用抗性平板（卡那霉素）篩選陽性克隆。

菌落PCR篩選陽性菌落的PCR反應使用Taq DNA聚合酶，所用引物分別為5′-CCGCGGATCCATGTCCAGAAGGCTTCGCAG-3′和5′-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，51 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min。提取PCR鑒定的陽性菌株質粒進行Bgl Ⅱ 酶切鑒定。將酶切鑒定符合預期的質粒，命名為pET28apykA，送樣進行DNA測序。然后把序列正確的重組載體pET28apykA轉化進大腸桿菌BL21細胞，即得到 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的表達宿主。

1.2.3 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導蛋白表達。

挑取BL21/pET28apykA單克隆過夜培養。過夜菌液按1∶100接種于1 L LB培養基中，37 ℃振蕩培養2 h至對數生長中期，OD600為0.6。加入誘導劑IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，22 ℃振蕩培養過夜。

1.2.4 蛋白純化。

將表達PykA蛋白的1 L菌液5 000 r/min離心20 min，收集細菌沉淀。用30 mL Solution I（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，200 mmol/L NaCl）重懸菌體，加入苯甲基磺酰氟（PMSF），用超聲波破碎細胞（工作時間5 s，暫停時間5 s，功率50%，總時間30 min），4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清，采用Ni親和層析柱純化 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA。用Solution Ⅰ 充分平衡Ni親和層析柱，粗蛋白溶液上樣后，用Solution Ⅱ （20 mmol/L TrisHCl，pH 7.6，200 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑）洗脫雜蛋白，用Solution Ⅲ （20 mmol/L TrisHCl，pH 7.6，200 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑）洗脫，收集洗脫峰，通過SDSPAGE電泳分析目的蛋白純度。蛋白洗脫液共7.5 mL，用截留分子量為10 kDa的半透膜和透析液Solution Ⅳ（20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，5% Glycerol，5 mmol/L MgCl2）進行透析。用Bradford法蛋白濃度測定試劑盒對蛋白質濃度進行測定。

1.2.5 HPLC鑒定蛋白活性。

PykA酶活性檢測在1 mL緩沖溶液中進行（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L Na2SO4，10 mmol/L MgCl2，0.05 mg/mL PykA，5 mmol/L PEP-K+，5 mmol/L ADP），30 ℃水浴鍋中反應1 h，并進行HPLC檢測。色譜柱為YMC-Pack Polya mine Ⅱ；洗脫液A為去離子水，洗脫液B為1 mol/L KH2PO4；反應產物用1 mol/L KH2PO4溶液進行梯度洗脫；在254 nm紫外波長處檢測洗脫峰。

2 結果與分析

2.1 進化分析

從NCBI數據庫中檢索了17個細菌、真菌及多細胞生物的丙酮酸激酶氨基酸序列。通過MEGA 7軟件，用最大似然法進行分析。由圖1可知，丙酮酸激酶的氨基酸序列保守，能夠反映物種進化規律。大腸桿菌的丙酮酸激酶PykF、PykA與其他細菌，如德氏乳桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌的氨基酸序列同源性更高，體現了更近的親緣關系。

2.2 pET28a-pykA的構建

以大腸桿菌基因組DNA為模板，用PCR方法擴增得到了丙酮酸激酶基因。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，DNA片段大小與電泳結果相符（圖2）。用PCR產物純化試劑盒對PCR產物進行純化。用限制性內切酶Xho Ⅰ、BamH Ⅰ分別對pykA基因和載體pET28a進行限制性酶切、連接并轉化到TOP10感受態細胞中。挑取7個單克隆進行菌落PCR檢驗，菌落PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖3a所示，1～7號泳道均檢測出單一條帶，根據電泳的DNA片段大小，顯示了這7個克隆均為陽性克隆。為了進一步驗證該陽性克隆，又用SanPrep柱式質粒DNA小量提取試劑盒提取了1個陽性菌株的質粒，并進行了Bgl Ⅱ 限制性酶切鑒定。如圖3b所示，酶切后的瓊脂糖凝膠電泳顯示2條DNA條帶，大小與預期（5 964和814 bp）相符。菌落PCR與酶切檢驗均正確的質粒送樣測序，DNA測序結果正確，克隆的基因中未發生堿基突變。

2.3 蛋白表達與純化

經過菌落PCR、酶切及DNA測序均顯示正確的表達質粒，轉化到大腸桿菌BL21菌株中，用IPTG誘導過夜。取誘導前后的菌，細胞破碎后通過SDS-PAGE電泳，檢測蛋白表達情況。結果如圖4a所示，泳道1顯示未誘導細菌的總蛋白，泳道2為誘導細菌的總蛋白。結果顯示誘導后在55 kDa附近有較明顯的蛋白條帶，與 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA蛋白分子量大小一致。為了得到純化的 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA蛋白，利用鎳柱進行蛋白純化。如圖4b所示，泳道1為純化前的細菌蛋白粗液，泳道2為純化后的蛋白，純化后的蛋白只有1條目的蛋白條帶，純化效果很好。利用Bradford法蛋白濃度測定試劑盒對純化后的目的蛋白PykA進行定量，蛋白濃度為2 mg/mL，共從1 L培養液中獲得20 mg純化的 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA。

2.4 HPLC鑒定PykA酶活

丙酮酸激酶催化ADP生成ATP。為了 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的活性，在1 mL緩沖溶液中進行了酶促催化反應，以ADP為底物，在30 ℃水浴鍋中反應1 h后，用高壓液相色譜進行檢測。圖5a顯示了AMP、ADP、ATP標準品的保留時間分別為19、32、48 min。取PykA催化ADP生成ATP的反應混合物，過濾樣品后通過HPLC進行了檢測。結果見圖5b，反應1 h后，反應混合物中ATP占97.9%，ADP含量降至2.1%以下，表明在 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的催化作用下，有97.9%的ADP被轉化生成ATP。

3 結論

構建了大腸桿菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的原核表達載體pET28-pykA，并在宿主大腸桿菌BL21中實現了高效表達。經過Ni親和層析柱純化得到高純度的 Ⅱ 型丙酮酸激酶。該酶可以在1 h內將5 mmol/L ADP轉化為ATP，轉化效率為97.9%，顯示了大腸桿菌 Ⅱ 型丙酮酸激酶PykA的良好催化能力。該工作為ATP酶法合成及ATP再生系統等后續研究提供了理論依據。

參考文獻

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