UPLC法測定整參·須根和蘆頭中人參皂苷的含量

趙琳琳 趙云平 魏靜娜

摘要 [目的]建立適用于整參、須根、蘆頭中人參皂苷的超高效液相色譜（UPLC）檢測方法，同時測定人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量。[方法]采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）分離，流動相為乙腈-0.1 mol/L磷酸溶液，梯度洗脫，檢測波長為203 nm，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min。[結果]人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、RC、Rb2、Rd線性關系良好，回收率在87.3%～98.6%。[結論]該方法準確、重復性好，適用于整參、須根、蘆頭中人參皂苷的定量分析。

關鍵詞 人參皂苷；超高效液相色譜法；整參；須根；蘆頭

中圖分類號 S567.5+1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）28-0138-03

Abstract [Objective] The research aimed to establish a chromatographic separation method for the determination of ginsenosides in the whole ginseng， fibrous root and root refs.Ginsenosides Rg1，Re，Rf，Rg2，Rb1，Rc，Rb2 and Rd were determined.[Method]The separation was performed by a ACQUITY UPLC BEH C18 column （1.7 μm， 2.1 mm× 50 mm）， the mobile phase was acetonitrile -0.1% phosphoric acid aqueous solution with gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min， the detection wavelength was set at 203 nm， and the column temperature was 35 ℃. [Result]The method showed a good linear relationship of ginsenosides Rg1， Re， Rf， Rg2， Rb1， Rc， Rb2， Rd.Recovery rate was from 87.3% to 98.6%.[Conclusion]This method is accurate and good reproducibility，and suitable for the determination of ginsenosides in the whole ginseng， fibrous root and root refs.

Key words Ginsenosides； UPLC； Whole ginseng；Fibrous root；Root refs

人參（Panax ginseng C.A.Mey）為五加科植物人參的根，是我國珍貴中草藥材[1-2]，主要功能有復脈固脫、補脾益腎、生津養血、安神益智。研究表明，人參具有抗腫瘤、神經系統活性、心腦血管系統活性、調節免疫系統等作用[3]。人參中有多種獨特活性成分包括人參皂苷、人參揮發油、人參多糖、人參多肽等，其中人參皂苷含量的高低是考察人參質量的重要評價指標[4-5]。

人參皂苷可通過抑制癌細胞增殖、減少癌細胞侵襲和轉移、影響癌細胞周期、誘導癌細胞自噬并促進細胞凋亡等方面發揮抑癌功效，國內外學者從分子水平上研究了人參皂苷及其衍生物抗結腸癌的作用機制，主要涉及到了線粒體通路、內質網應激以及WNT/β-catenin信號通路，通過抑制結腸癌細胞的生長，降低新生血管的生成，減少癌細胞的侵襲和遷移，最終誘導結腸細胞自噬和凋亡[6]。人參皂苷Rg1與Rb1作為人參益智作用的主要活性成分，可通過改變腦內主要神經遞質的量、信號轉導途徑中蛋白分子等，改善動物的學習記憶行為能力[7]。張有為等[8]利用細胞計數法、流式細胞術和熒光染色法檢測了27種人參皂苷和皂苷元對體外培養的人體骨肉瘤細胞U2OS的增殖、細胞周期和細胞死亡的影響，結果發現人參皂苷均有不同的抗U2OS活性，其中Rf活性最強。人參皂苷Rb1能夠通過上調脂肪組織周脂素的表達，減少游離脂肪酸的釋放和甘油三酯的異位沉積，這可能是其改善機體胰島素抵抗和糖代謝異常的作用機制之一[9]。周玥等[10]利用Sca-1+HSC/HPC連續移植建立Sca-1+HSC/HPC小鼠衰老體內模型，研究人參皂苷Rg1延緩衰老的作用與相關衰老信號分子之間的關系，為人參皂苷Rg1抗衰老作用提供試驗依據。通過上述文獻報道可以看出，人參皂苷在現代醫學疑難病的治療中發揮的作用得到了深入的研究。

人參皂苷類成分分析多采用高效液相色譜串聯紫外分光光度法、高效液相色譜串聯質譜法、高效液相色譜串聯蒸發光散射檢測法、薄層色譜法、比色法等[11-14]，其中高效液相色譜串聯二極管陣列檢測器法因其準確度高、穩定性和重復性較好而得到廣泛應用，但人參皂苷類成分結構差異在糖的位置、數量，極性非常相近難以達到很好的分離[15]，導致色譜分析時間需要80～100 min才能將其有效分離。筆者采用超高效液相色譜（UPLC）串聯二極管陣列檢測器，在保持較高分離度的前提下，將分離時間控制在35 min以內，建立了整參、須根、蘆頭中8種人參皂苷定量分析方法，為人參皂苷的合理開發提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 試材 參皂苷Rg1（批號R-015-130823，純度≥98%），人參皂苷Re（批號R-020-131117，純度≥98%），人參皂苷Rf（批號R-021-131217，純度≥98%），人參皂苷Rg2（批號R-016-131228，純度≥98%），人參皂苷Rb1（批號R-021-131122，純度≥98%），人參皂苷Rc（批號R-008-131128，純度≥98%），人參皂苷Rb2（批號R-013-131111，純度≥98%），人參皂苷Rd（批號R-009-130826，純度≥98%），均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；二氯甲烷（AR）、正丁醇（AR）均購自天津市風船化學試劑科技有限公司；磷酸（HPLC級）購自天津光復精細化工研究所；乙腈（HPLC級）購自Merck公司；水為超純水。

1.2 儀器 超高效液相色譜儀Waters Quatemary Solvent Manager；超聲波清洗器為AS系列超聲波清洗器，天津Autoscience儀器有限公司；電子分析天平METTLER AB54、METTLER XS205。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件。色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）：流動相為乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B）；梯度洗脫：0～4 min（19%A），4～11 min（19%A～25%A），11～33 min（25%A～33%A），33～34 min（33%A～19%A），34～40 min（19%A）；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長203 nm；進樣量2 μL。

1.3.2 對照品溶液的配制。精密稱取8種人參對照品，加甲醇溶解，配置濃度為人參皂苷Rg1 0.507 mg/mL、Re 0.508 mg/mL、Rf 0.407 mg/mL、Rg2 0.392 mg/mL、Rb1 0.867 mg/mL、Rc 0.351 mg/mL、Rb2 0.395 mg/mL、Rd 0.608 mg/mL的混合標準溶液。

1.3.3 供試品溶液制備。分別精密稱取整參、須根、蘆頭粉末0.2 g（精確到±0.0001 g），置索式提取器中，加入二氯甲烷80 mL，加熱回流3 h后，棄去二氯甲烷液，殘渣揮干溶劑，連同濾紙移入錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇25 mL，密塞，浸泡4 h，超聲30 min，濾過，用水飽和正丁醇少量多次沖洗濾紙，合并濾液和洗液，放置于蒸發皿中，蒸干，殘渣加甲醇溶解轉移至2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度搖勻，濾過，即得。

1.3.4 方法學考察。

1.3.4.1 系統適應性試驗。分別吸取對照品溶液及供試品溶液各2 μL，在“1.3.1”色譜條件下，注入液相色譜儀進行測定，記錄色譜圖。

1.3.4.2 線性關系的考察。取“1.3.2”人參皂苷混合標準溶液50、100、150、200、250 μL于10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，得到人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd系列標準混合溶液，以不同濃度為橫坐標、不同濃度對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4.3 精密度試驗。精密吸取人參皂苷混合標準溶液2 μL，按照“1.3.1”操作步驟連續6次進樣，測得8種人參皂苷的RSD。

1.3.4.4 穩定性試驗。取同一供試品溶液，以“1.3.1”色譜條件，每次進樣2 μL，分別在2、4、8、12、16、20、24 h進樣，測定8種人參皂苷的RSD。

1.3.4.5 回收率試驗。精密稱取已知含量整參樣品6份，每份0.1 g，加入對照品溶液，按照“1.3.3”制備供試品溶液，再按“1.3.1”色譜條件測定峰面積，計算平均回收率和RSD。

1.3.5 樣品含量測定。分別取整參、須根、蘆頭2個批次樣品，每個樣品做6個平行，按照“1.3.3”方法制備供試品溶液，精密吸取2 μL，按“1.3.1”色譜條件進行測定，外標法計算樣品中的平均含量。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 系統適應性試驗。從圖1可以看出，Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd的色譜峰與相鄰的色譜峰的分離度均大于1.5，Rg1、Re也可以有效分離，說明此條件適合人參皂苷的測定。

2.1.2 線性關系的考察。按照“1.3.4.2”操作，得到8種人參皂苷標準混合溶液，以不同濃度為橫坐標、不同濃度對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得出人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb、Rc、Rb2、Rd的線性回歸方程分別為：Y=45 804x-32 340（r=0.999）、Y=38 838x-15 476（r=0.998）、Y=48 246x-15 729（r=0.997）、Y=40 851x-2 3731（r=0.996）、Y=32 643x+2 790（r=0.998）、Y=33 112x-12 734（r=0.996）、Y=31 943x-5 350（r=0.999）、Y=40 657x-1 2313（r=0.998），表明8種人參皂苷分別在0.254～1.266、0.254～12.270、0.204～1.018、0.196～0.980、0.434～2.168、0.176～0.878、0.198～0.988、0.304～1.520 μg/mL線性關系良好。

2.1.3 精密度試驗。按照“1.3.4.3”操作，連續6次進樣，測得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd的RSD分別為0.88%、0.97%、0.18%、2.19%、1.67%、0.20%、1.75%、0.88%，表明精密度良好。

2.1.4 穩定性試驗。按照“1.3.4.4”操作，測定人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd的RSD分別為2.06%、2.17%、2.74%、1.91%、2.83%、2.75%、1.98%、1.70%，表明樣品在24 h內穩定。

2.1.5 回收率試驗。從表1可以看出，8種人參皂苷回收率為87.3%～98.6%，RSD為1.04%～2.77%，表明該方法準確、可靠，符合相關要求。

2.2 樣品含量測定 從表2可以看出，整參、須根和蘆頭中Rf、Rg2和Rd的含量較低，整參和須根中Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2含量較高；蘆頭中Rg1、Re含量較高。不同樣品中人參皂苷含量由高到低的順序為須根、整參、蘆頭。

3 結論與討論

在樣品提取過程中，先嘗試了水飽和正丁醇直接提取和水提后利用D101大孔樹脂凈化，前者進樣后雜質較多，分離度較差，后者回收率較低。故筆者在水飽和正丁醇提取之前比較了乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷脫脂，乙酸乙酯脫脂效果不佳，二氯甲烷與三氯甲烷脫脂后，樣品峰可以有效分離，但三氯甲烷毒性較大，該試驗采用二氯甲烷來進行脫脂；同時又比較了水飽和正丁醇浸泡時間，分別為1、2、4、8、16、24 h，人參總皂苷浸泡4～16 h含量變化不大，故采用浸泡4 h。該研究最終采用方法為二氯甲烷脫脂后，水飽和正丁醇浸泡4 h超聲處理，進樣雜質峰干擾較少，分離度較好。

流動相的選擇比較了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液。乙腈-0.1%甲酸溶液不能有效分離并且基線波動較明顯；乙腈-水色譜峰可以分離，但是人參皂苷Rg1與Re極性相似，出峰時間接近，2個峰不能完全有效分離。該研究采用乙腈-0.1%磷酸溶液，乙腈在4～11 min，比例從19%逐漸變化到25%的過程中，Rg1與Re可有效分離。

試驗結果表明，整參、須根和蘆頭中Rf、Rg2和Rd的含量較低，整參和須根中Rg、Re、Rb1、Rc、Rb2含量較高；蘆頭中Rg1、Re含量較高。雖然人參須不作為主要的用藥部位，但是因其人參皂苷含量較高，可以考慮特殊用藥情況下人參須代替人參作為用藥部位。該試驗結果為人參皂苷的提取與用藥提供參考依據，因試驗樣品數量有限，為了進一步的統籌分析，還需增加樣品數量進行數據累積。通過試驗中UPLC方法優化縮短了進樣分析時間，增加方法準確性，并且方法穩定性好，回收率較高，適用于人參皂苷類物質的定量分析。

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