羊耳菊活性部位在大鼠循環腸灌流液中的代謝產物研究

鞏仔鵬 李梅 侯靖宇

摘要 [目的]采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（UHPLC-Q-TOF/MS）研究羊耳菊提取物在大鼠循環腸灌流液中的代謝產物。[方法]收集健康SD大鼠循環腸灌流液，分別用甲酸水溶液和正丁醇處理樣品后，UHPLC-Q-TOF/MS分析其代謝產物。結合對照品、質譜碎片信息和相關文獻，初步推測代謝產物的結構。[結果]大鼠循環腸灌流液中的代謝物較少，初步鑒定出3個代謝產物，主要存在二咖啡酰基奎寧酸酯基位置異構和甲基化代謝物。[結論]該方法初步探究了羊耳菊提取物主要成分在大鼠循環腸灌流液中的代謝特征，為闡釋羊耳菊藥材的藥效物質基礎提供理論依據。

關鍵詞 羊耳菊；活性部位；腸灌流液；代謝產物

中圖分類號 R927.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）28-0122-03

Abstract [Objective]To investigated the metabolites of Inula cappa extract in the intestinal circulating perfusion fluid of rats by UHPLCQTOF/MS.[Method]The healthy intestinal perfusion fluid of SD rats was collected and the samples were treated with formic acid aqueous solution and nbutanol respectively.Identification and structural elucidation of the metabolites were performed by comparing the changes in molecular masses，retention times and full scan metabolisms （MS） spectra with those of the parent drug，and the relative data of authentic reference.[Results] There were fewer metabolites in the intestinal circulating perfusion fluid of rats，and three metabolites were identified.There were mainly isomers and methylated metabolites of dicaffeoylquinic acid ester groups.[Conclusion]The method is used to study the metabolic characteristics of the main components of the extract of Inula cappa extract in the intestinal circulating perfusion fluid of rats，and to provide the theoretical basis for elucidating the pharmacological basis of the herbs.

Key words Inula cappa；Active parts；Intestinal circulating perfusion fluid；Metabolites

羊耳菊為菊科植物羊耳菊[Inula cappa（Buch.-Ham.ex D.Don）DC.]的干燥全草，具有疏風散熱、解毒消腫的功效，是貴州苗族常用藥材，苗語藥名為“Bex nioux dant”（近似漢譯音為“白牛膽”），在《苗族醫藥學》《中華本草·苗藥卷》、2003 版《貴州省中藥、民族藥質量標準》中均有收載[1-3]。在傣族，羊耳菊又名“納罕” ，為傣醫名方“雅叫哈頓散”（收載于 2010年版《中國藥典》一部）的主藥。 《中國民族藥志》記載[4]：除苗族、傣族外，羊耳菊在我國壯、侗、景頗、拉祜、傈僳、苗、彝、佤等少數民族地區均有豐富的藥用經驗，常用于感冒發熱、咽喉腫痛、風濕疼痛、癰瘡疔毒、乳癰等癥，有獨特療效。但羊耳菊基礎研究薄弱一直是亟待解決的技術問題，特別是羊耳菊的藥效物質基礎一直未能明確，導致產品工藝和質量控制水平低，很難保證羊耳菊及其相關產品的質量和療效[5]，并已成為制約羊耳菊產品升級換代和產業鏈做大做強的瓶頸。

藥物代謝是指藥物吸收和分布之后在血液或組織中的生物轉化過程，生物轉化的產物稱為代謝產物。在實際工作中常見許多中藥提取物在血中根本檢測不到原型藥物成分，但藥效卻是顯而易見的，究其原因可能是代謝產物發揮了治療作用[6]。因此，通過代謝研究，可以明確中藥吸收進入體內的成分及其存在形式，進而闡明其代謝途徑和機制，從而初步明確其藥效物質。羊耳菊藥材的臨床研究相關報道較多，但鮮有針對其體內吸收代謝情況的研究報道。腸道不僅是藥物吸收的必經主要部位，其存在的代謝酶和相關轉運蛋白也同時參與藥物的生物轉化過程，因此藥物在腸道循環過程，不僅存在吸收過程，還伴隨著藥物代謝。而在體腸灌流模型不僅是研究藥物吸收的簡單可行的研究方法，更能夠應用于藥物腸道代謝特征的研究，相較于各種體外代謝研究方法，更加直觀和可靠[7-9]。因此該研究采用大鼠在體腸灌流模型研究羊耳菊活性部位在大鼠循環腸灌流液中的代謝產物，對其在腸道中可能的代謝物進行初步研究，以期為闡釋羊耳菊藥材的藥效物質基礎提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。木犀草苷、綠原酸對照品，批號分別為111720-201408、110753-201415，均購于中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸、隱綠原酸、1，3-O-二咖啡酰基奎寧酸、3，4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和4，5-二-O-咖啡酰基奎寧酸對照品，批號分別為X20-20141012、Y58-20141012、1384-101215、1384-101215、S34-110121、1384-101215，均購于中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心；羊耳菊藥材購自貴州龍里縣，由貴州醫科大學藥學院生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為菊科植物羊耳菊[Inula cappa（Buch.-Ham.ex D.Don）DC.]的干燥全草。

1.1.2 儀器。超高壓效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜儀（Agilent Technologies 1290 Infinity液相色譜系統，布魯克道爾頓四極桿-飛行時間質譜儀）；Allegra 64R低溫高速離心機（Beckman Coulter）；MTN-2800D氮吹儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）。

1.1.3 試驗動物。健康SD大鼠，雌雄兼用，體重為（250±20） g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供[合格證號：SCXK （渝）2015-0001]。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制。

1.2.1.1 Krebs-Ringers （K-R）營養液的配制。

稱取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、NaHCO3 1.37 g、NaH2PO4 0.32 g、MgCl2 0.02 g、CaCl2 0.37 g、葡萄糖 1.40 g，用少量蒸餾水溶解，其中CaCl2單獨溶解后逐滴加入，葡萄糖臨用加入，溶解后用蒸餾水定容至1 L。

1.2.1.2 羊耳菊活性部位供試液的制備。

取羊耳菊藥材12 kg，充分混勻，取10倍量60%乙醇，提取3次，每次1 h，合并3次濾液，減壓濃縮，回收乙醇，得12 L濃縮液。上述濃縮液用D101大孔樹脂吸附（徑高比1∶4），加水洗脫至流出液無顏色后，再用60%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，得浸膏，微波真空干燥即得，得膏率為7 %，-4 ℃條件干燥保存，備用。經測定，羊耳菊提取物中木犀草苷、1，3-二咖啡酰基奎寧酸、3，4-二咖啡酰基奎寧酸、3，5-二咖啡酰基奎寧酸、4，5-二咖啡酰基奎寧酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的含量依次為0.74%、2.01%、3.82%、3.56%、3.87%、2.17%、0.99%、3.36%。

取適量提取物，加入適量的K-R營養液，超聲10 min，5 000 r/min 離心10 min，取上清液備用，獲得2.5、5.0、10.0 mg/mL 的供試液。

1.2.2 Q-TOF MS/MS質譜條件。

電噴霧離子源；掃描方式為負離子掃描（ESI-，m/z 50～1 000）；毛細管電壓：ESI-（3.5 kV）、ESI+ （4kV）；離子源溫度200 ℃；霧化氣（N2）壓力1.2 bar；干燥氣溫度200 ℃；氣體體積流量6 L/min；準確質量測定采用甲酸鈉校正標準液；校正模式選用Enhanced Quadratic；數據分析采用Data Analysis軟件、Metabolite Tools、質量虧損過濾（MDF）等。

1.2.3 UHPLC色譜條件。

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；流動相為0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；進樣體積為5 μL。梯度洗脫條件：0～1 min，5%～10 %A；1～13 min，10%～28%A；13～16 min，28%～100%A；16～17 min，100%A，17～18 min，100%～5%A。

1.2.4 灌流液樣品處理。

取灌流液樣品1 mL， 加入100 μL 1%的甲酸水溶液， 再加入500 μL正丁醇，渦旋混合5 min，萃取3次，合并正丁醇層萃取液，8 000 r/min 離心10 min，取上清液于37 ℃下N2吹干，殘渣加1 mL正丁醇渦旋混合溶解后，10 000 r/min 離心10 min，取上清液37 ℃下N2吹干，殘渣加200 μL 50 %甲醇水溶解，15 000 r/min 離心10 min，上清液進樣UHPLC-Q-TOF/MS分析。

1.2.5 羊耳菊活性部位在大鼠循環腸灌流試驗中灌流液的收集。

給藥前大鼠禁食24 h，自由飲水。手術前腹腔注射30%烏拉坦（1.4 g/kg）麻醉，固定于恒溫手術臺，37 ℃保溫，剃毛。沿腹中線腹腔開口3～4 cm，小心分離十二指腸，并結扎總膽管，再分離出試驗腸段，上端切口插入小硅膠管，縫合固定，連接恒流泵，下端切口插入硅膠管，固定，與恒流泵形成回路。灌流前，用37 ℃的生理鹽水以1.0 mL/min 的流速，沖洗腸道至凈，然后排空水分。取37 ℃羊耳菊灌流液50 mL，先以5 mL/min 流速循環平衡15 min 后，將流速調節為 2.5 mL/min，立即讀出循環液體積并自循環液量筒中取樣1 mL，作為零時間藥物濃度的樣品，另向量筒中補加K-R 緩沖液1 mL，于3 h時同法取灌流液，并結束試驗。試驗開始前收集一次空白灌流液，并收集在體循環灌流試驗結束時3 h的灌流液樣品，備用。

1.2.6 灌流液樣品中的代謝產物鑒定。采用UHPLC-Q-TOF/MS法檢測，并運用Bruker公司的Data Analysis軟件，得到生物樣品的總離子流圖，二級質譜圖，再結合Metabolite Predict軟件預測的羊耳菊活性部位中多個有效成分的可能代謝產物，并將生成的Masslist導入Metabolite Detect軟件中，推測出其可能的代謝產物。

2 結果與分析

由Metabolite Detect得到空白灌流液、灌流液樣品及差異圖譜見圖1，灌流液中共檢測到3個代謝產物（表1），鑒定結果如下。

（1）M1。在5.8 min處存在m/z 543.127 2[M-H]-的準分子離子峰，比二咖啡酰基奎寧酸多C2H4，裂解后，產生的m/z 367.103 2碎片離子比單咖啡酰基奎寧酸多CH2，同時m/z 193.055 9碎片離子比咖啡酸負離子多CH2，故初步推斷M1可能是二咖啡酰基奎寧酸的雙甲基化產物。

（2）M2和M3。保留時間分別為9.2和9.4 min的準分子離子峰分別為m/z 515.119 2[M-H]-、515.120 2[M-H]-，它們均產生m/z 353.087 0和m/z 353.088 3的碎片離子，與3，4-二咖啡酰基奎寧酸和3，5-二咖啡酰基奎寧酸的分子式和質譜碎片相似，但保留時間不一致，通過與對照品對比，M2和M3可能為二咖啡酰基奎寧酸在大鼠體內發生酯基位置異構而產生的。

3 討論

該研究建立UHPLC-Q-TOF/MS對灌流液中的羊耳菊活性部位在大鼠灌流液中代謝產物檢測方法，其具有離子傳輸效率高、傳輸離子質量范圍寬、靈敏度高、錯誤率低、重現性高等優點，并結合超高壓液相（UHPLC）的高靈敏度和基

線穩定性為研究帶來了優良的分析能力。試驗中18 min即可完成對復雜生物樣品的檢測，該方法可對檢測樣品色譜信

息進行全采集，且各色譜峰分離較好，為后期分析處理海量的代謝數據奠定基礎。此外，樣品檢測時選用甲酸鈉溶液為高分辨質譜質量準確度校正標準液。批量液質聯用分析時，可每個樣品進行單獨校正，以消除儀器長時間運行時造成數據波動，確保數據準確性。在每個樣品的數據中，都有標準品進入質譜，可運用DataAnalysis Version 4.0軟件中選擇相對應的標準品列表與校正模式，對數據進行自動匹配并校正。

在藥物體內外代謝研究中，對代謝產物數據的分析處理是重點也是難點。因此，該研究運用布魯克公司研發的數據處理工具Metabolite Tools TM對代謝信息進行分析。其中包含Metabolite Predict和Metabolite Detect 這2個相關軟件，首先根據藥物中原型成分的結構特征及其在體內可能發生的代謝變化，選擇相應的代謝途徑，由Metabolite Predict軟件預測出龐大的代謝產物Masslist；將Masslist導入至MetaboliteDetect中，與差異圖譜進行匹配，通過差異分析對可能的代謝產物進行定性分析。該研究中發現羊耳菊活性部位在大鼠灌流液中代謝產物較少，主要存在二咖啡酰基奎寧酸酯基位置異構和甲基化代謝物，為闡釋羊耳菊藥材的藥效物質基礎提供理論依據。

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