果蔬農藥殘留快速檢測固定化酶片的制作研究

張登科 郝程列 鐘凱

摘要 [目的]對膽堿酯酶的保藏性進行研究分析，以期得到保障農藥殘留檢測的最佳酶活力。[方法]試驗選定高酶活力的大豆酯酶為酶原，通過篩選最適反應溫度、反應時間、離子濃度和最適pH，及最佳的反應顯色體系來確定反應最適的條件，采用不同的顯色體系酶抑制法，研究酶片的制作方法。[結果]酶片載體材料采用硝酸纖維膜，制作每張酶片取20 μL大豆酶液，15 μL 0.5%的BSA溶液，2 μL 0.05%戊二醛于平底試管中。添加0.03 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液至總體積100 μL，4 ℃固定10 h；制作每張顯色片，需在1 cm×1 cm大小的濾紙片上加入50 μL顯色劑，30 μL底物，4 ℃冷風吹干，封膜真空保存。[結論] 固蘭B鹽和α-乙酸奈酯組合，適合作為酶抑制法檢測有機磷農藥殘留的顯色劑，且效果明顯。

關鍵詞 大豆；膽堿酯酶；農藥殘留；酶片

中圖分類號 TS207.5+3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）28-0081-04

Abstract [Objective]The preservation of cholinesterase was studied in order to guarantee the best enzyme activity of pesticide residue detection. [Method] The soybean esterase with high enzyme activity was selected as zymogen， optimum reaction conditions by screening the optimal reaction temperature， reaction time， concentration and pH， reaction and the best color system were determine.The method of making enzyme tablets was studied by using different color system and enzyme inhibition method.[Result]Nitrocellulose membrane was used for enzyme piece of material， which made each enzyme take 20 μL soybean enzyme liquid， 15 μL 0.5% BSA solution， 2 μL 0.05% glutaraldehyde to the bottom of the tube.Add 0.03 mol/L pH 7.0 phosphate buffer and the total volume was 100 μL， 4 ℃ fixed 10 h.Made each color piece， should add 50 μL chromogenic agent in 1 cm×1 cm filter size， 30 μL substrates， 4 ℃ cold wind blow dry， sealing membrane vacuum preservation. [Conclusion]The combination of solid blue B salt and αnaphthyl acetate is suitable for the detection of organophosphorus pesticide residue by enzyme inhibition method， and the effect is obvious.

Key words Soybean；Cholinesterase；Pesticide residues；Enzyme slices

農藥殘留是農藥使用后一個時期內未被分解而殘留于生物體、收獲物、土壤、水源、大氣中的微量農藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質的總稱[1-2]。農藥殘留檢測酶抑制法，是基于農藥的毒性機理來進行測定的，農藥在生物體內能與乙酰膽堿酯酶結合，且不易分離[3-4]，乙酰膽堿酯酶的活性受有機磷和氨基酸甲酸酯類農藥的特異性抑制，喪失了水解底物的活力[5]，致使神經傳導中的乙酰膽堿不能水解而積累，影響神經的信號、遞質的正常傳遞，神經持續興奮，發生抽搐等，導致昆蟲中毒甚至死亡[6]。根據有機磷農藥對酶促反應具有抑制作用這一毒理學特性，建立了酶抑制法檢測農產品中有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留[7-8]。其中由于植物酯酶的成本大大低于動物性的乙酰膽堿酯酶，且來源廣泛易得，因此植物酯酶抑制法測定農藥殘留是一種很經濟適用的方法[9-10]。該試驗著重研究酶抑制法的關鍵工作酶——植物酯酶，從大豆中提取植物酯酶，將提取出來的植物膽堿酯酶固定到載體上，制作成快速檢測酶片，提高酶活力，也探究提高植物酯酶的保藏期，解決膽堿酯酶難以保存的問題，用于農藥殘留的快速現場檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與主要試劑。

東北大豆，購自天津紅旗農貿市場；α-乙酸奈酯，天津傘科技有限責任公司；硝酸纖維膜（NC），北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；牛血清白蛋白（BSA），Ruibio分裝，合肥博美生物科技有限責任公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙酮、戊二醛、苯，均為分析純，購自天津市化學試劑三廠；氧樂果，天津京津農藥廠。

1.1.2 主要儀器設備。

JJ-2型組織搗碎勻漿機，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；EX224電子天平，奧豪儀器（上海）有限公司；國華SHZ-82恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；LD5-2B低速離心機，北京雷勃爾離心機有限公司；722N可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；LGJ-18S冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶液制備。

大豆用組織搗碎機粉碎成粉末，按料液比1∶5（g∶mL）分別稱取適量的大豆粉，加入pH 7.0 濃度為0.03 mol/L的磷酸緩沖液，4 ℃浸泡12 h后振蕩30 min，以5 000 r/min離心10 min，上清液濾紙過濾得到粗酶液，冷藏備用，同時測定粗酶液酶活力。

1.2.2 大豆酯酶最適反應條件。

1.2.2.1 最適反應溫度。

分別在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃下測定酶活力，確定最適反應溫度。

1.2.2.2 最適pH測定。

分別在pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的緩沖液中測定酶活力，確定最適pH。

1.2.2.3 確定緩沖液的最適離子濃度。

設定緩沖液的離子濃度分別為0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045 mol/L，分別測定其酶活力，繪制曲線圖，確定其最適離子濃度。

1.2.3 酶活力的測定。

1.2.3.1 原酶液吸光度值的測定及不同用量顯色劑時溶液的顯色效果。

在試管中加入20 μL酶液和2.40 mL pH 7.0的磷酸緩沖液（對照管加2.45 mL），然后加入50 μL底物α-乙酸奈酯溶液，將試管都置于30 ℃水浴中反應15 min，向各試管中再加入50 μL固蘭B液，放在30 ℃水浴鍋中反應10 min，立即在波長595 nm處測定吸光度[4]。

1.2.3.2 2種顯色劑對比試驗。

該試驗分別采用固蘭B鹽和2，6-二氯酚靛酚鈉作顯色劑進行效果對比，添加相同量的農藥稀釋液，測定吸光度值，計算酶抑制率，比較顯色劑的效果。

1.2.3.3 抑制率計算方法。計算公式如下：

抑制率（%）=[（△A0-△At）/△A0]×100%

式中，△A0為對照管吸光度值；△At為抑制管吸光度值。

1.2.4 農藥氧樂果不同稀釋濃度下對酶的抑制率。

該試驗將農藥氧樂果分別稀釋成不同濃度，稀釋倍數分別為10、20、30、50、100、150、200、250、300、400、500、1 000，測定不同農藥濃度下酶的吸光度變化，計算酶抑制率。

1.2.5 大豆酯酶的固定及酶片和顯色片的制作。

1.2.5.1 試驗組①。

分別將硝酸纖維膜和濾紙剪成1 cm×1 cm的小片，放進0.03 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液中，4 ℃浸泡48 h。一次性取40 μL大豆酶液，30 μL 0.5%的BSA溶液，4 μL 0.05%戊二醛于平底試管中。添加0.03 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液至總體積200 μL，將上述液體在漩渦混合器上混勻，取活化好的硝酸纖維膜浸入液體中，4 ℃下固定10 h。取出酶片，用pH 7.0的PBS溶液沖洗數次。4 ℃自然吹干或者用冷風吹干，封膜真空保存。

1.2.5.2 試驗組②。

如圖1，酶片制作流程：將濾紙剪成1 cm×1 cm大小的卡片，每片上加入20 μL酶液，20 μL底物α-乙酸奈酯丙酮溶液。

顯色片制作流程（圖1）：

顯色片有2種方案，一種采用0.8%的固蘭B溶液制作，另一種采用0.5%的2，6-二氯酚靛酚鈉制作。顯色片的制作，在1 cm×1 cm大小的濾紙片上加入50 μL顯色劑，30 μL底物，4 ℃冷風吹干，封膜真空保存。

2 結果與分析

2.1 大豆酯酶原酶液活力測定

由表1可知，通過浸泡提取的原酶液活性較高，吸光度值達到0.844，說明大豆可以作為植物膽堿酯酶提取的試驗材料。

2.2 最適反應溫度

如圖2可知，20～65 ℃下測定酶活力，大豆酯酶的最適反應溫度在25～40 ℃，在30 ℃酶的活力最高。

2.3 最適pH測定

圖3所示是在30 ℃溫度下，在pH 4.5～8.5范圍緩沖溶液中測定酶活力大小，大豆酯酶在pH 7.0～8.0范圍內活性最高，其活力在pH 7.5時最高。

2.4 確定緩沖液的最適離子濃度

如圖4所示，在0.010～0.045 mol/L不同離子濃度的緩沖溶液中測定酶活力，離子濃度在0.020～0.040 mol/L體系中大豆酯酶活力最大，其最大酶活力值在離子濃度為0.030 mol/L。

2.5 不同用量顯色劑對酶活力的影響

由圖5可知，當顯色劑固蘭B的用量不同時，溶液的吸光度值不一樣，用量和吸光度值呈正相關，當將顯色劑固定到白色濾紙載體上時，應使用較高用量，或者使用較高濃度，避免白色濾紙片對顏色的掩蓋作用，使顏色分明，方便觀察。

由表2可知，僅從酶的抑制率效果來看，使用2，6-二氯酚靛酚鈉作顯色劑，酶抑制率效果非常明顯，平均抑制率326.07%，但試驗發現，在不加酶的情況下，2，6-二氯酚靛酚鈉依然褪色，從而得出結論，2，6-二氯酚靛酚鈉不適合作有機磷農藥殘留快速檢測的顯色劑。使用固蘭B作顯色劑，檢測酶抑制率效果相對較差，但是比較穩定。綜合考慮，固蘭B鹽更適合作有機磷農藥快速檢測的顯色劑。

2.6 氧樂果不同稀釋濃度下對酶的抑制率

由表3可知，酶抑制率與農藥濃度呈正相關，農藥稀釋濃度越大，酶抑制率越低，當稀釋1 000倍時，酶抑制率還能達到10%左右。由此可見，氧樂果的藥效較強。

2.7 比較2種顯色片的效果

組合一見圖6，固蘭B、α-乙酸奈酯組合，將稀釋一定濃度后的農藥滴加到酶片上（圖6中編號2、3），對照組滴加相同量蒸餾水（圖6中編號1），保持酶片濕潤，將顯色片覆蓋在酶片上，稍等片刻，編號1的酶片上沒有農藥，膽堿酯酶未受抑制，遇到顯色劑，產生紫紅色（由于色差，顏色更接近褐色）變化；編號2、3的酶片由于滴加了農藥，膽堿酯酶受到抑制，顯色片不變色。根據顏色變化和顏色深淺即可初步判斷農藥含量，農藥含量越高，顏色越深，農藥含量越低，顏色越淺。

組合二見圖7，2，6-二氯酚靛酚鈉做顯色劑，將稀釋一定濃度后的農藥滴加到酶片上（圖7中編號2、3），對照組滴加相同量蒸餾水（圖7中編號1），保持酶片濕潤，將顯色片覆蓋在酶片上，顯色片立即產生變化，編號1的酶片上沒有農藥，膽堿酯酶未受抑制，遇到顯色劑，藍色顯色片不發生變化；編號2、3的酶片由于滴加了農藥，顯色片的藍色立即褪色，數秒后藍色全部褪去。

試驗發現，在不添加酶的情況下滴加農藥藍色依然褪去，由此說明2，6-二氯酚靛酚鈉不適合做有機磷農藥殘留快速檢測的顯色劑。

2.8 酶片測試結果 如圖8所示，分別用稀釋30倍（有效成分0.013 mg/kg）的氧樂果對固蘭B酶片進行試驗，觀察顯色效果，可看出依然能有效抑制酶活性，酶片不發生變化。試管抑制試驗中，農藥稀釋1 000倍，抑制率依然達到10.3%。

3 結論

大豆酯酶作為一種廉價易得的植物酯酶，其最適反應溫度為30 ℃，pH 7.5時酶的活性最高，緩沖液離子濃度在0.02～0.04 mol/L體系中大豆酯酶活力最大，其最大酶活力吸光度值為0.844。粗酶液在4 ℃和-20 ℃ 2個保藏溫度下隨著保藏天數的延長，酶活力均呈下降趨勢，4 ℃保藏條件下的酶活力下降速度快于-20 ℃保藏條件，至保藏36 d時酶活力幾乎完全喪失。

酶片采用硝酸纖維膜，制作每張酶片取20 μL大豆酶液，15 μL 0.5%的BSA溶液，2 μL 0.05%戊二醛于平底試管中，添加0.03 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液至總體積100 μL，4 ℃固定10 h；制作每張顯色片，需在1 cm×1 cm大小的濾紙片上加入50 μL顯色劑，30 μL底物，4 ℃冷風吹干，封膜真空保存。

固蘭B鹽和α-乙酸奈酯組合，適合作為酶抑制法檢測有機磷農藥殘留的顯色劑，且效果明顯。

參考文獻

[1] 趙建莊，梁桂芝，柴麗娜，等.乙酰膽堿酯酶分離純化的方法[J].北京農學院學報，2003，18（4）：249-251.

[2] 王松.蔬菜中有機磷農藥殘留測定方法的研究[D].南京：南京農業大學，2009.

[3] 涂憶江.我國農藥殘留快速檢測技術的研究與應用現狀[J].農藥科學與管理，2003，24（4）：14-16.

[4] 魏福祥，王振川，王金梅.乙酰膽堿酯酶生物傳感器法測定蔬菜水果中有機磷農藥殘留[J].食品科學，2007，28（2）：229-231.

[5] 黃捷，馬雙成.中藥農藥殘留檢測中前處理方法的應用現狀及展望[J].中國藥師，2011，14（7）：1036-1039.

[6] 雷明，張檀，文建雷，等.農藥殘留檢測用植物酯酶的篩選[J].西北植物學報，2008，28（1）：183-187.

[7] 劉春紅，馮志彪.以α-乙酸萘酯為底物植物酯酶活力測定條件的優化[J].食品工業科技，2008，29（6）：145-147，151.

[8] 董超，史延茂，張麗萍，等.采用植物酯酶測定農藥殘留量的研究[J].農藥，2001，40（9）：19-20.

[9] 許娟，李建科，牛樂.農藥殘留快速檢測固定化酶片的研究[J].食品科學，2008，29（6）：268-272.

[10] 田子華.酶抑制法農藥殘留快速檢測技術研究[D].南京：南京農業大學，2005.