廣州市售水產品副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐藥性評估

冼鈺茵 余翀 阮榮勇

摘要 [目的]研究廣州市售水產品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐藥性情況。[方法]采用Kirby-Bauer紙片擴散法檢測從水產品中分離的87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌對水產養殖業中常用的18種抗生素的耐藥情況。[結果]水產品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌均對萬古霉素、克林霉素以及青霉素類抗生素有明顯抗性，多重耐藥比例達100%，溶藻弧菌的多重耐受現象較為突出。[結論] 廣州市售水產品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌具有多種抗生素抗性，且多重耐藥情況突出。

關鍵詞 副溶血弧菌；溶藻弧菌；耐藥性；多重耐藥

中圖分類號 S948 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）28-0074-04

Abstract [Objective] To investigate the drug resistance of Vibrio parahemolytics and Vibrio alginolyticus in aquatic products from Guangzhou retail markets. [Method] KirbyBauer disk diffusion method was used to detect the antibiotic resistance of 87 isolates of V. parahemolytics and 118 isolates of V. alginolyticus in aquatic products to 18 kinds of antibiotics widely used in aquaculture industry. [Result] Both V. parahemolytics and V. alginolyticus were resistant to vancomycin， clindamycin and penicilins. All the isolates exhibited multidrug resistance， while V. alginolyticus isolates showed outstanding multiple antibiotic resistance. [Conclusion] V. parahemolytics and V. alginolyticus in aquatic products from Guangzhou retail markets were resistant to many kinds of antibiotics， they also exhibited complex multidrug resistance.

Key words Vibrio parahemolytics；Vibrio alginolyticus；Drug resistance；Multidrug resistance

副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽細菌，主要分布于海水、海底沉積物以及魚、蝦、貝類等海產品中，不僅是水產養殖業的重要病原菌，而且是人類主要的食源性致病菌之一[1-3]。我國是副溶血弧菌引發食物中毒的高發地區，由該病原菌感染引發的急性腸胃炎占細菌性食物中毒的首位，在某些沿海城市比例高達60%以上[4-5]。溶藻弧菌雖然是水生環境中的優勢菌種，同樣會引起水生動物感染，但其對人類的致病性不如副溶血弧菌強，屬于條件致病菌。鑒于溶藻弧菌的致病性弱于霍亂弧菌、創傷弧菌和副溶血弧菌等典型弧菌病原菌，臨床癥狀相對較輕，一般不會導致死亡，且目前尚未出現溶藻弧菌大規模暴發的疫情，因此對其致病性和耐藥性的研究也相對薄弱[6-8]。

目前，水產養殖業中抗生素的過度使用問題日益嚴重。用藥種類廣、劑量大、頻次高等問題不僅會造成不良的生態學效應，藥物殘留及藥物的選擇壓力致使病原菌對抗生素的敏感性下降甚至消失，而且增加了防治水產病害的難度，其耐藥性甚至可能發生轉移，對人體健康構成進一步的威脅[9-12]。筆者針對從廣州市售水產品中分離的87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌，選取水產養殖業中常用的18種抗生素進行藥敏試驗，旨在研究廣州市售水產品分離的副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐藥性情況，以期為水產養殖過程中抗生素的合理規范應用提供指導，為弧菌耐藥基因的定位和耐藥機制的研究以及水產品的安全性評估提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

藥敏性測定標準質控菌株大腸桿菌ATCC 25922，由廣東省出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心食品實驗室微生物部提供。87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌來自廣州地區多個肉菜市場售賣的水產品，品類涵蓋花螺、花甲、青口、沙甲、白貝、大頭蛤、沙蛤、鮑魚、扇貝、海瓜子、蟶子和貴妃蚌。

1.2 培養基及藥敏紙片

用于培養弧菌的特異性培養基TCBS和用于藥敏性試驗的培養基MHA均購自北京陸橋技術股份有限公司；用于弧菌液體培養的3% NaCl堿性蛋白胨水購自青島海博生物技術有限公司。藥敏紙片的選擇按照美國臨床實驗室標準化研究所（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）推薦的腸桿菌藥敏試驗抗生素選擇原則，結合我國水產養殖業抗生素使用特點，選擇使用的18種抗生素及其劑量見表1。18種抗生素的Oxoid藥敏紙片，購自華粵瑞科科學器材有限公司。

1.3 藥敏試驗

在TCBS培養基上活化副溶血弧菌和溶藻弧菌后，挑取單菌落接種于3% NaCl的TSB培養基中37 ℃過夜培養后，用生理鹽水稀釋菌液至濃度為0.5麥氏濁度，以無菌棉拭子蘸取稀釋后的菌液，均勻涂布于4 mm厚的MHA平板上，操作過程嚴格按照美國臨床實驗室標準化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的Kirby-Bauer紙片擴散法[13]進行。37 ℃下倒置培養16～18 h后，測量抑菌圈直徑，再根據CLSI標準判定為耐藥（resistant）、中介（intermediate）以及敏感（sensitive）。

2 結果與分析

2.1 副溶血弧菌分離株的藥敏試驗結果

由表2可知，水產品中的副溶血弧菌對抗生素的耐藥現象相當普遍，87株副溶血弧菌都呈現出不同程度的抗生素抗性，其中最突出的是萬古霉素，耐藥率高達100%，其次是耐藥率達到95.40%的克林霉素。此外，副溶血弧菌分離株對鏈霉素和青霉素類抗生素（如阿莫西林、氨芐西林）有明顯抗性，耐藥率均超過75%。通過比較副溶血弧菌分離株對不同抗生素的敏感程度可知，水產品中的副溶血弧菌對慶大霉素、四環素、復方新諾明、頭孢哌酮和環丙沙星較為敏感。

2.2 溶藻弧菌分離株的藥敏試驗結果

由表3可知，水產品中的溶藻弧菌對抗生素的耐藥現象更為普遍，118株溶藻弧菌分離株均對萬古霉素和克林霉素有抗性，對阿莫西林、氨芐西林、羧芐西林等青霉素類抗生素的耐藥率均在90%以上。此外，還對鏈霉素和頭孢類抗生素（如頭孢唑啉、頭孢呋辛鈉和頭孢噻吩）有明顯抗性，但對同屬于頭孢類抗生素的頭孢哌酮則非常敏感。通過比較溶藻弧菌分離菌株對不同抗生素的敏感程度可知，水產品中的溶藻弧菌對頭孢哌酮、環丙沙星、慶大霉素、四環素和復方新諾明較為敏感，與副溶血弧菌分離株基本一致。

2.3 副溶血弧菌分離株的多重耐藥情況及相關耐藥譜分析

87株副溶血弧菌分離株均存在多重耐藥情況，有4株副溶血弧菌對多達9種抗生素具有抗性，多重耐藥菌株的比例見圖1。其中60%以上的菌株同時對6種及以上的抗生素具有抗性，這55個菌株的多重耐藥譜見表4。

2.4 溶藻弧菌分離株的多重耐藥情況及相關耐藥譜分析

118株溶藻弧菌分離株均存在多重耐藥情況，且多重耐藥情況比副溶血弧菌更為嚴重，有5株溶藻弧菌對多達12種抗生素具有抗性，溶藻弧菌分離株的多重耐藥菌株的比例見圖2。其中，75%以上的菌株同時對9種及以上的抗生素具有抗性，這90個菌株的多重耐藥譜見表5。

3 結論與討論

筆者選取水產養殖業中常用的18種抗生素，采用Kirby-Bauer紙片擴散法研究從廣州市售水產品分離的87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌的耐藥性情況，發現這2種弧菌對抗生素的耐藥現象相當普遍，所有菌株都呈現出不同程度的抗生素抗性，而且多重耐藥情況十分突出，達到100%，溶藻弧菌的多重耐藥情況尤為嚴重。通過分析這些弧菌分離株的耐藥情況，整理出典型菌株的多重耐藥譜，可為水產養殖過程中抗生素的合理規范使用提供有效指導，有利于水產養殖業的可持續健康發展。此外，通過試驗獲得的耐藥性研究結果對于掌握水產品中的副溶血弧菌和溶藻弧菌的耐藥現狀及風險評估具有重要的現實意義，并為副溶血弧菌和溶藻弧菌耐藥基因定位和耐藥機制的研究提供參考資料。

Kirby-Bauer紙片擴散法是一種定性測定細菌耐藥性的方法，由于其具有操作簡單，價格便宜，不需要專門的儀器設備，而且形成了標準化、規范化的操作流程等優勢，目前已廣泛應用于各種細菌耐藥性的研究。但是，應注意此方法的試驗結果受細菌接種量、藥敏紙片質量、培養基的成分與厚度、具體試驗操作等因素的影響，只有嚴格按照CLSI的標準執行才能有效減少這些因素對試驗結果的影響，避免假性耐藥和假性敏感情況的出現。

該研究發現，副溶血弧菌和溶藻弧菌分離株具有多重耐藥性。與國內外同類數據對比，筆者調查的廣州地區副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重耐藥情況更為突出和集中[14-16]。副溶血弧菌和溶藻弧菌作為水產養殖業中的主要病原菌，在水產養殖過程中投放的抗生素其抗菌譜大多數會覆蓋這2種弧菌，從而促使這2種弧菌在反復接觸這些抗生素后逐步形成抵御抗生素作用的能力，產生對多種抗生素不同程度的抗性，形成了這種多藥耐受局面[10，12]。此外，細菌間耐藥質粒的水平遷移也有可能加劇水產品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的多重耐藥情況。耐藥質粒可以通過接合、轉導等途徑在弧菌之間傳播，使敏感菌株獲得耐藥基因，從而產生抗生素抗性，實現弧菌耐藥性的傳播[17]。

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