無硫復合護色劑處理的干制蘋果片中差異蛋白表達的分析

李新明 郭志利 李群

摘要 [目的]分析經無硫復合護色劑處理的蘋果片在干制后差異蛋白的表達情況。[方法]采用無標記（Label-free）定量蛋白質組學技術對復合護色劑處理的干制蘋果片進行蛋白質組學研究，探討蛋白質組表達水平的差異。所提取的蛋白質樣品經酶解、色譜質譜檢測分析，用Label-free定性定量軟件maxquant（1.5.0.12）結合搜庫定性軟件Andromeda，對每個樣本進行定性定量，通過蛋白質相對定量的比較尋找差異表達蛋白。[結果]與非處理蘋果片相比，差異蛋白總數為909個，上調差異蛋白質319個，下調差異蛋白質590個；生物學過程主要集中在代謝過程、細胞過程。分子功能主要在綁定、催化活性、能量代謝等部分。細胞組件主要集中在細胞膜相關的部件。[結論]該研究可為解析復合護色劑處理后干制蘋果片中次生代謝物差異的成因及其抑制褐變的蛋白質機制提供參考。

關鍵詞 干制蘋果片；Label-free；褐變；護色；差異蛋白

中圖分類號 TS255.42 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）28-0071-03

Abstract [Objective] To analyze the expression of differentially expressed proteins in dried apple slices treated with sulfur free composite color protection agent.[Method] Proteomic analysis of dry apple slices treated with composite color protection agents was carried out using unlabeled （Labelfree） quantitative proteomic techniques to investigate the differences in protein expression levels.The analysis of the extracted protein samples by enzymolysis and GCMS detection，using Labelfree quantitative software maxquant （1.5.0.12） combined with qualitative database search software Andromeda，the qualitative and quantitative of each sample，the protein relative quantitative comparison for different expression of protein.[Result] Compared with untreated apple slices，the total number of differentially expressed proteins was 909，up to 319 differentially expressed proteins and 590 down regulated proteins.The biological process mainly focused on the metabolic process and the cellular process.The molecular functions were mainly binding，catalytic activity，energy metabolism and so on.Cell components were mainly concentrated in cell membrane related components.[Conclusion] This study can provide a reference for the analysis of the causes of the secondary metabolite differences in the dried apple slices and the mechanism of protein inhibition of browning.

Key words Dried apple slices；Labelfree；Browning；Color protection；Differential proteins

蛋白質組學分析方法已經在許多領域得到廣泛應用，如生命科學領域（細胞生物學、神經生物學等），涉及的生物種類范圍很多，如原核生物、真核生物、植物和動物等。在醫學領域，蛋白質組學將成為尋找疾病分子標記和藥物靶標最有效的方法之一[1]。蛋白質組學分析研究中需要使用多種方法，鑒定蛋白質需要應用質譜方法，標記或染色等可以通過定量分析等方法來完成。如今，不使用其他方法，同時實現蛋白質的定性和定量僅靠質譜就可完成，這就是無標記（Label-free）定量蛋白質組學研究方法，也是現在定量蛋白質組學研究的有效新方法，它直接利用蛋白質質譜鑒定中產生的肽段數據（重復肽段數和強度）進行蛋白相對定量[2-4]。

去皮后蘋果的果肉褐變主要為酶促褐變，導致褐變的酶有很多種，其中多酚氧化酶是最主要的，酶促反應的進行需要4個因素，即氧、多酚氧化酶、底物、銅離子[5]。抑制這種反應可以通過除去氧，降低活性銅離子和底物濃度或直接鈍化酶來實現[6]。還有一種褐變為非酶褐變。在蘋果干制過程中，溫度會引起果肉中各種蛋白的表達變化，通過檢測這些功能蛋白的差異表達，可以從分子水平為褐變抑制提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料 供試蘋果為太谷產的紅富士蘋果。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理。洗凈蘋果，將蘋果切成 1 mm的薄片，均等分成2份；其中一份放置于空氣中 4 h，同時另一份置于復合護色液中浸泡 4 h；將2份蘋果放置于 45 ℃烘箱中烘至恒重。

1.2.2 蛋白質提取。

取樣品 100 mg 于 5 mL 管中，加入 5 顆鋼珠，液氮凍存 5 min，放入高通量組織研磨儀中，70 Hz 1 min；加入 1 mL Lysis buffer，漩渦振蕩 30 s，冰上靜置10 min；加入 100 mg 玻璃珠，漩渦振蕩 30 s 后立即放入冰上冷卻，重復 6 次；15 000 r/min 4 ℃離心 30 min，收集上清液；加入終濃度 25%的 TCA于-20 ℃ 2 h 沉淀蛋白，15 000 r/min 4 ℃離心10 min，去上清，蛋白沉淀用 80%丙酮洗滌3 次，小心去掉上清液，晾干 2～3 min；用 300 μL 8 mol/L urea（100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0）復溶蛋白沉淀，BCA 蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度，樣品濃度最好≥2 mg/mL；樣品置于-80 ℃內，待酶解。

1.2.3 蛋白質的酶解。先將蛋白用 10 mmol/L DTT 在 37 ℃ 下進行變性處理，隨后加入 20 mmol/L IAA（iodoacetamide）室溫反應 45 min 進行還原烷基化處理，蛋白樣品用 100 mmol/L TEAB 稀釋至尿素終濃度為 1 mol/L，首先加入 trypsin （1∶50） 過夜進行第1次酶解，第2次用 1∶100 trypsin 進行酶解 4 h。大概每個樣本有 100 μg 的蛋白用 trypsin 進行了酶解。

在用 trypsin 進行酶解后，肽段混合物用 5%甲酸進行酸化處理后，通過 C18 Spin Columns 進行除鹽處理；除鹽洗脫產物用 Pierce TM Quantitative Colorimetric Peptide Assay 試劑盒進行定量，凍干，最后用一定量的流動相（0.1%甲酸水溶液）復溶肽段。

1.2.4 色譜質譜檢測流程。

檢測用 LTQ orbitrap Velos液質聯用儀配備戴安ultramate 3000 nano-UPLC 進行分析，上機量 10 μL，首先進入保護柱（C18 PepMap100，300 μm×1 mm，5 μm，100 ），隨后進入分析柱（AcclaimPepMap C18，15 cm×75 μm，2 μm，100 ，Dionex）以流速 0.2 μL/min 進行分析，流動相梯度為 5%～55%流動相 B（流動相 B：乙腈，0.1%甲酸；流動相 A：超純水，0.1%甲酸）以 180 min 進行檢測。

質譜參數：陽離子模式，CID 碰撞模式，120 000 分辨率，質量范圍 350～1800，NCE 為 35%，前15 離子強度用于 MS-MS 分析。

1.3 分析方案

Orbitrap原始數據定性定量方法：對獲得的Label free蛋白質原始數據，用Label free定性定量軟件maxquant（1.5.0.12）結合搜庫定性軟件Andromeda，對每個樣本進行定性定量，參考蛋白質數據庫為uniprot（收錄了共34 361條記錄）。定性和檢索方法：對每個樣本進行“運行間匹配”，匹配時間窗口為0.5 min，對齊時間窗口為20 min。酶切類型為胰蛋白酶全酶切，母離子質量誤差為±10×10-6，固定修飾為半胱氨酸，可變修飾為天冬酰胺、賴氨酸（肽段N端）和蛋氨酸（氧化），肽段和蛋白FDR<0.01，最少匹配unique peptide數目為1，同時采用LFQ和iBAQ兩參數進行蛋白定量，對獲得的蛋白結果過濾掉污染序列、反向序列等獲得最后的結果用于后續分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白鑒定統計分析

經過定性定量分析，一共有15 180個潛在多肽的MS-MS數據，最終經過maxquant搜庫以后共有7 988個多肽的MS-MS數據可以歸屬到已知蛋白，最終樣本可以識別到1 797個蛋白（unique peptide≥1）。

2.2 功能注釋

2.2.1 總體蛋白GO分析。

蛋白參與的生物過程（BP）、所處的細胞位置（CC）、發揮的分子功能（MF）三方面功能信息是GO數據庫的重要包含內容，可以把不同的功能概念組合為DAG（有向無環圖）的結構。在蛋白表達譜分析中，GO常用于提供蛋白功能分類標簽和蛋白功能研究的背景知識。利用GO的知識體系和結構特點，旨在發掘與蛋白差異表達現象關聯的單個特征蛋白功能類或多個特征功能類的組合。

圖1為GO的第2級（level 2）注釋信息所整理的GO分布圖。可以發現生物學過程主要集中在代謝過程、細胞過程。分子功能主要集中在綁定、催化活性、能量代謝等部分。細胞組件主要集中在細胞膜相關的部件。

2.2.2 差異蛋白分析。

2.2.2.1 柱狀圖分析。對A-/A+各蛋白的比例進行柱狀圖分析，考察蛋白的比例分布，發現大多數蛋白的比例的對數位于0附近（圖2）。

2.2.2.2 差異分析。最后篩選LFQ信號強度差異倍數的log2值的絕對值在log2（1.5）以上[|log2（Fold change）|≥log2（1.5）]為最終差異的蛋白，最終獲得差異蛋白數。差異蛋白總數為909個，其中下調總數為590個，上調總數為319個。

ID：蛋白編號，log2（A-/A+）：組別間倍性變化值的log2值，uniprot列為經過蛋白搜庫之后的匹配結果。

3 結論

經復合護色劑處理的蘋果片，在干制后，果肉中的蛋白差異表達分析并與非處理對照比較表明，差異蛋白總數為909個，其中下調總數為590個，上調總數為319個。其中，生物學過程主要集中在代謝過程、細胞過程。分子功能主要在綁定、催化活性、能量代謝等部分。細胞組件主要集中在細胞膜相關的部件。

參考文獻

[1]尹穩，伏旭，李平.蛋白質組學的應用研究進展[J].生物技術通報，2014（1）：32-38.

[2] 趙慧輝，楊帆，王偉，等.無標記定量法研究冠心病不穩定性心絞痛血瘀證的差異蛋白質組[J].高等學校化學學報，2010，31（2）：285-292.

[3] 郭春燕，詹克慧.蛋白質組學技術研究進展及應用[J].云南農業大學學報，2010，25（4）：583-591.

[4] 楊倩，王丹，常麗麗，等.生物質譜技術研究進展及其在蛋白質組學中的應用[J].中國農學通報，2015，31（1）：239-246.

[5] 姜愛麗，鐘璐，胡文忠，等.3種褐變抑制劑對減輕鮮切蘋果褐變效果的影響[J].食品與發酵工業，2010，36（7）：45-48.

[6] 魏敏，周會玲，陳小利，等.低溫貯藏對鮮切富士蘋果褐變的影響[J].西北林學院學報，2011，26（5）：131-134.