防治西瓜枯萎病的微生物菌種的篩選與鑒定

陳允亮 毛慧淵 陶黎明

摘要 [目的]對(duì)一組防治西瓜枯萎病的微生物菌種進(jìn)行鑒定。[方法]以西瓜專化型尖孢鐮刀菌為研究對(duì)象，從海洋海綿共生菌和土壤樣品中篩選到6株具顯著拮抗西瓜專化型尖孢鐮刀菌的活性菌株，并對(duì)該6株活性菌株進(jìn)行分子鑒定。[結(jié)果]分子鑒定顯示該6株活性菌株均屬于芽孢桿菌屬的物種。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為西瓜枯萎病類安全高效的生物農(nóng)藥及功能型生物肥料的創(chuàng)制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 枯萎病；生物防治；尖孢鐮刀菌；芽孢桿菌

中圖分類號(hào) S436.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）28-0011-03

Abstract [Objective] The aim was to identify microorganism against watermelon Fusarium wilt.[Method] The Fusarium oxysporum f.sp.niveum was taken as the research object and six strains with significant antagonistic activity to Fusarium oxysporum f.sp.niveum from symbiotic bacteria of marine sponges and soil samples were screened， and the six active strains was identified through molecular biological characterization.[Result] The molecular biological characterization showed that these six active strains all belonged to Bacillus.[Conclusion] The conclusion of this study lays a foundation for new type of safe and efficient biological pesticide and functional biological fertilizer towards watermelon wilt.

Key words Wilt；Biological control；Fusarium oxysporum；Bacillus

西瓜是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其種植面積和產(chǎn)量均居世界第一位[1-2]。西瓜汁液含有豐富的礦物鹽、糖分、水分和多種維生素，成為夏季消費(fèi)佳品，栽培西瓜具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。因此，近年來(lái)西瓜生產(chǎn)發(fā)展迅速，但由于連作重茬，病害日益嚴(yán)重，也稱之為“連作障礙”，并已成為西瓜生產(chǎn)的重要制約因素[2]。西瓜枯萎病是一種嚴(yán)重的真菌病害，可以造成植株大面積死亡，產(chǎn)量減少（減產(chǎn)15%以上），品質(zhì)下降（含糖量降低），其病原為尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）[3-4]。西瓜枯萎病是一種土傳病害，在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生[5]。以浙江、上海地區(qū)的西瓜種植為例，瓜農(nóng)為避免連作障礙的發(fā)生，需要每年更換西瓜種植土地，進(jìn)行輪作，這在當(dāng)前我國(guó)耕地越來(lái)越稀缺的背景下，極大地增加了瓜農(nóng)的用地成本及生產(chǎn)資料搬遷帶來(lái)的額外勞動(dòng)負(fù)擔(dān)。筆者以西瓜枯萎病的致病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）作為研究對(duì)象，從海洋海綿共生菌和土壤樣品中篩選到多株具有顯著拮抗Fusarium oxysporum f.sp.niveum的6株活性菌株，并進(jìn)行了16S-rDNA分子鑒定，以期為西瓜枯萎病類安全高效的生物農(nóng)藥及功能型生物肥料的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。

尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）由江蘇大學(xué)環(huán)境學(xué)院戴志聰博士提供，尖孢鐮刀菌西瓜專化型拮抗菌株由華東理工大學(xué)藥學(xué)院陶黎明教授提供。

1.1.2 培養(yǎng)基。

受試菌種子培養(yǎng)基選擇LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL。

尖孢鐮刀菌種子培養(yǎng)基選擇肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏15 g，氯化鈉15 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 7.2。

拮抗試驗(yàn)培養(yǎng)基選擇肉湯瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏15 g，氯化鈉15 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂18 g，調(diào)節(jié)pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與拮抗試驗(yàn)。

將受試菌和尖孢鐮刀菌種子分別劃線到肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板表面，30 ℃過夜培養(yǎng)12 h以上；挑取受試菌單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃過夜振蕩培養(yǎng)，挑取尖孢鐮刀菌單菌落于肉湯瓊脂培養(yǎng)基中，30 ℃過夜振蕩培養(yǎng)。次日分別吸取受試菌和尖孢鐮刀菌菌液各30 μL滴加于肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板兩側(cè)，待平板吹干后，置于30 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，觀測(cè)拮抗效果。

1.2.2 菌種鑒定。

將篩選到的拮抗活性菌株分別提取DNA，以16S-rDNA/18S-rDNA/26S-rDNA D1/D2區(qū)的序列引物對(duì)上述基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增到的DNA片段連接至pMD18-T Vector載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得陽(yáng)性克隆后送上海生工進(jìn)行測(cè)序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast程序?qū)y(cè)序獲得的序列進(jìn)行同源性檢索，與GenBank數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌西瓜專化型拮抗菌株的篩選

利用肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板共培養(yǎng)方法，從海洋海綿共生菌和土壤樣品中初步篩選到具有明顯拮抗活性的菌株共6株，分別標(biāo)記為S2036NH14-2、S2037NH17-3、S2038NH7-6、S2039NH11-1、S20405-1 B1和S20414-27-1。將上述6株活性菌株和尖孢鐮刀菌西瓜專化型菌株進(jìn)一步共培養(yǎng)于同一塊肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板，其拮抗效果見圖1。

2.2 菌種鑒定

當(dāng)以細(xì)菌的16S-rDNA引物27F（AGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）對(duì)上述6株拮抗菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)能夠擴(kuò)增到1.3～1.5 kb的特征性條帶（圖2），進(jìn)一步將上述條帶克隆至pMD18-T Vector，隨后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，各菌株鑒定結(jié)果見表1。

3 結(jié)論與討論

該研究以西瓜專化型尖孢鐮刀菌為研究對(duì)象，從不同來(lái)源樣本（海洋海綿共生菌及土壤樣品）中篩選其拮抗菌株，對(duì)其進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示6株拮抗菌株分別為芽孢桿菌屬的Bacillus velezensis、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。國(guó)內(nèi)外將芽孢桿菌應(yīng)用于生物防治已有60多年的歷史。1945年Johnson等[6]報(bào)道，枯草芽孢桿菌具有防治植物病害的作用。此后，用枯草芽孢桿菌制備生防制劑防治植物病害的研究成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Lewis等[7]報(bào)道，枯草芽孢桿菌可以防治水稻等作物的多種土傳真菌病害。Lee等[8]報(bào)道，用枯草芽孢桿菌可以防治豌豆的 Rhizoctoni根腐病害。20世紀(jì) 90 年代后，國(guó)外已有多種枯草芽孢桿菌制劑投放市場(chǎng)。

進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著微生物分子生物學(xué)研究方法的革新、基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的芽孢桿菌全基因組序列予以公布，在此基礎(chǔ)上研究人員在芽孢桿菌中分析鑒定到近20種天然產(chǎn)物生物合成基因簇及其代謝產(chǎn)物，主要包括脂肽類、聚酮類（PKS）、羊毛硫肽類、硫肽類等。Schneider等[9]、Liu等[10]在解淀粉芽孢桿菌中繼bacillaene和difficidin后鑒定了新的Polyketide天然產(chǎn)物Macrolactin的生物合成途徑及其化學(xué)結(jié)構(gòu)（圖3）。Luo等[11]研究表明，枯草芽孢桿菌916中除了產(chǎn)生傳統(tǒng)的脂肽類天然

產(chǎn)物如表面活性素（surfactins）、bacillomycin Ls（iturins伊枯草菌素家族）和（泛革素）fengycins，還可產(chǎn)生一類稱之為locillomycins新的脂肽類化合物（圖4），并對(duì)其生物合成基因簇進(jìn)行了比較（圖5）。Qin等[12]通過對(duì)解淀粉芽孢桿菌L-S60的全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，L-S60除了產(chǎn)生傳統(tǒng)的surfactin、iturin和 fengycins類脂肽，還在其基因組中發(fā)現(xiàn)了一些促進(jìn)生長(zhǎng)荷爾蒙分泌、生物膜形成和揮發(fā)性化合物產(chǎn)生的相關(guān)基因。Chen等[13]從青藏高原牦牛糞便中分離到生防菌Bacillus velezensis LM2303，并對(duì)其基因組進(jìn)行全測(cè)序，通過序列分析發(fā)現(xiàn)，Bacillus velezensis LM2303基因組除了編碼Iturin、Fengycin和 surfactin的NRPS（nonribosomal peptide synthetases）傳統(tǒng)生物合成基因外，還包括一些新的如硫肽類Kijanimicin的生物合成基因等（表2）。

綜上，該研究篩選到的6株拮抗西瓜枯萎病致病菌的活性菌株皆屬于芽孢桿菌屬，有其必然性，芽孢桿菌豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成能力是其強(qiáng)大抗真菌活性的根本保證。

該研究結(jié)論較好地印證了此前諸多關(guān)于芽孢桿菌可用于生物防治及其生防機(jī)制的相關(guān)報(bào)道，也為新型、環(huán)境友好的生物農(nóng)藥及功能型（抗病）生物肥料的創(chuàng)制奠定了基礎(chǔ)。

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