枯草芽孢桿菌發酵產N—乙酰神經氨酸的分離提純

高蘭蘭 袁麗霞 吳金勇

摘要 [目的]對GRAS認證的枯草芽孢桿菌發酵所得N-乙酰神經氨酸進行分離純化，獲得安全性高的目的產物。[方法]通過沸水浴破壁、菌液分離、活性炭脫色、乙醇分步沉淀除雜、乙酸結晶以及重結晶等工藝對枯草芽孢桿菌基因工程菌株經培養所得的N-乙酰神經氨酸發酵液進行分離純化。[結果]分離純化后，N-乙酰神經氨酸純度在96.0%以上。[結論]研究結果為N-乙酰神經氨酸應用于食品、保健品等領域提供了質量保障。

關鍵詞 枯草芽孢桿菌；N-乙酰神經氨酸；純化

中圖分類號 S-3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）28-0001-02

Abstract [Objective] The aim was to separate and purify of Nacetylneuraminic acid from Bacillus subtilis which has a Generally Recognized as Safe （GRAS） status to get the safe and good production.[Method] After the fermentation of Bacillus subtilis in right medium，Nacetylneuraminic acid，was obtained by eradicating cell wall in boiling water，separating impurity，decolorization process，ethanol precipitation，acetic acid crystallization，recrystallization and other steps.[Result] Through the high performance liquid chromatography （HPLC） detection，the purity of Nacetylneuraminic acid reached above 96.0%.[Conclusion] The results provide reference for the application of Nacetylneuraminic acid in health products and other fields.

Key words Bacillus subtilis；Nacetylneuraminic acid；Purification

N-乙酰神經氨酸，又稱唾液酸（簡稱SA），屬于唾液酸家族中最主要的一員。唾液酸是20世紀50年代最早從頜下腺黏蛋白中分離純化而命名的，帶有極強的負電荷，是一類含有9個碳原子且具有吡喃糖結構的酸性氨基糖的總稱[1-2]。唾液酸屬于神經氨酸的衍生物，廣泛分布在各生物組織內，是細胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成分[3]，在許多糖與蛋白相互作用的生理過程中發揮著重要作用。由于唾液酸中大多數是N-乙酰神經氨酸，僅有少部分是以N-羥乙酰基神經氨酸、去氨基神經氨酸等形式存在，所以通常所說的唾液酸主要是指N-乙酰神經氨酸[4]。N-乙酰神經氨酸與人類有著密切的聯系，能夠促進嬰幼兒大腦發育，可被應用于治療流感、風濕性關節炎等疾病，與瘤細胞的黏附和轉移有關，賦予細胞抗識別等眾多生理功能與用途[5-8]，所以被廣泛應用到食品、醫藥品、疾病診斷等領域，如添加到嬰幼兒奶粉中，用于抗流感病毒扎那米韋的研發。因此，N-乙酰神經氨酸具有很大的經濟價值與應用前景。

N-乙酰神經氨酸的生產方法有很多，如天然原料提取法、固定化酶法、全細胞生物催化法等[9-10]，而微生物發酵法由于生產成本低，純化工藝相對簡單，克服了其他方法中存在的純化復雜、反應苛刻、成本高等缺點，成為了近幾年的研究熱點。目前，國內外主要是基于大腸桿菌基因工程菌發酵生產的研究，而關于枯草芽孢桿菌發酵產N-乙酰神經氨酸的報道相對較少。枯草芽孢桿菌是GRAS認證的安全菌株，遺傳背景清晰、生長速率快、不具有致病性、發酵及基因操作技術成熟，并且不易受噬菌體污染[11-12]，是一種重要的工業生產菌株。筆者研究了從枯草芽孢桿菌發酵液中提取N-乙酰神經氨酸的方法，以期獲得安全性高的目的產物，為其應用于食品、保健品等領域提供質量保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。枯草芽孢桿菌1505-SA-BS-G2-除芽孢由中國科學院合肥物質科學研究院等離子體物理研究所構建。

1.1.2 試劑與儀器。N-乙酰神經氨酸標準品：Sigma Aldrich公司；乙醇：國藥分析純；乙酸：國藥分析純；0.22 μm微孔濾膜：上海半島實業有限公司；臺式離心機：Allegra X-30R，Beckman公司；旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；正（負）壓過濾器：海寧市亞泰制藥機械有限公司。

1.1.3 培養基。

種子培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L。發酵培養基：甘油 20 g/L，酵母粉16 g/L，磷酸二氫鉀 5 g/L，硫酸銨 4 g/L，檸檬酸鈉 2 g/L，七水硫酸鎂 1 g/L，IPTG 2 mmol/L，VB1 0.004 9 g/L，微量元素 1 mL/L（微量元素母液：FeSO4·7H2O 3.500 g/L，MnCl2·4H2O 0.600 g/L，CoCl2·6H2O 0.100 g/L，CuCl2·2H2O 0.065 g/L，H3BO3 0.370 g/L，ZnSO4·7H2O 1.200 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.160 g/L）。

1.2 方法

1.2.1 發酵培養。

用接種環蘸取少量甘油管菌液，接種至10 mL液體LB培養基中，37 ℃、200 r/min培養5 h，得到一級種子液；將一級種子液1%接種量轉接至80 mL 液體LB培養基，同上培養；將微量元素和硫酸鎂的混合液，以及培養5 h的二級種子液，依次加入到各參數已穩定的5 L發酵罐中開始培養[pH設為6.80，通過25%（m/V）的氨水來維持調節pH。溫度設為37 ℃，溶氧保持在30%以上，開始發酵培養]。

該發酵采用補料分批發酵的方法，以甘油為主要碳源，發酵約4 h后甘油耗完，開始補加碳源，發酵約108 h，最終N-乙酰神經氨酸產量為8.6 g/L。

1.2.2 N-乙酰神經氨酸的分離提純。

1.2.2.1 破壁處理。將培養后的發酵液盛在敞口的玻璃器皿里，置于恒溫水浴鍋中，沸水浴加熱5 min（加熱過程中要確保攪拌均勻），使菌體細胞壁充分破壞，胞內產物釋放到液體中。

1.2.2.2 菌液分離。將破壁后的發酵液8 000 r/min離心5 min，收集上清液。

1.2.2.3 活性炭脫色。向上述上清液加入1%活性炭，室溫下攪拌10 min，用0.22 μm膜抽真空過濾，脫掉色素等部分雜質。

1.2.2.4 濃縮。將脫色后發酵液置于旋轉蒸發儀中，50 ℃下進行減壓蒸發濃縮，濃縮至80 g/L左右。

1.2.2.5 除蛋白。向上述濃縮液加入鹽酸，調節其pH為3.5，加入1倍體積乙醇溶液，攪拌均勻，靜置后出現白色絮凝狀沉淀（其成分主要為雜蛋白），用微濾膜抽真空過濾，收集上清液。

1.2.2.6 乙醇分步沉淀除雜。繼續濃縮上述上清液，同時回收乙醇，將其濃縮至80 g/L左右。重復上述步驟，調節pH后，加入乙醇再次沉淀除雜。

1.2.2.7 乙酸初結晶。繼續濃縮分步除雜后的上清液至200 g/L，加入4倍體積乙酸， 4 ℃結晶24 h。

1.2.2.8 洗滌干燥。用無水乙醇洗滌結晶后所得的晶體3次，60 ℃烘干至恒重，檢測N-乙酰神經氨酸含量。

1.2.2.9 重結晶。

用4倍體積乙酸對一次結晶后的樣品重結晶，無水乙醇洗滌并烘干，得重結晶樣品。

1.2.3 N-乙酰神經氨酸的檢測。

利用HPLC進行檢測樣品中N-乙酰神經氨酸的含量。高效液相色譜型號：島津Lc-15c。

檢測條件：檢測柱 Bio-Rad AMINEX HPX 87H Organic Analysis Column （300.0 mm×7.8 mm） ；柱溫 60 ℃；流動相是 6 mmol硫酸，流速0.6 mL/min；檢測波長 210 nm。

2 結果與分析

2.1 乙醇分步沉淀法的選擇

枯草芽孢桿菌培養后的發酵液比較黏稠，雜質較多，濃縮后的發酵液愈發黏稠，直接加乙酸結晶不能達到純化的目標。經過試驗，發現乙醇可除去部分蛋白和雜質，但因枯草芽孢桿菌發酵液中N-乙酰神經氨酸濃度不高，在8～10 g/L，發酵液大部分是雜質，高濃度濃縮后混合液變性成黏性的凝膠狀物質，再用乙醇處理很難除去雜質。經過多次研究發現，乙醇分步沉淀是一種有效去除蛋白質和雜質的方法。首先濃縮液濃縮到80 g/L左右，然后調pH至3.5，再加入1倍體積乙醇，然后采用微濾膜進行過濾。收集濾液，濾液再次蒸發濃縮，重復上述步驟，2次沉淀除雜后，即可除去大部分蛋白質和雜質。一次乙醇處理后有較多的雜質析出，且第2次1倍乙醇處理后仍可觀察到有雜質，說明1倍乙醇2次處理的必要性。因此，選用2步1倍乙醇沉淀法進行除雜。

2.2 結晶溶劑及結晶條件的確定

溶劑結晶法是生化分離過程中常用的提純方法，微生物發酵液中，一般含有大量的菌體、蛋白質、色素、無機鹽等雜質，這就需要通過各種理化方法對目標產物進行提純。利用溶劑結晶法，可以使雜質（結晶母液中）與產品（固體）分離開來，達到提純的目的。對于結晶溶劑的選擇，理論上應根據提純產物在溶劑中的溶解度、溶劑的介電常數和溶劑的理化性質等來考慮，一般選擇介電常數小、與水互溶性好的有機溶劑。通過對多種溶劑研究對比發現，雖然乙酸沸點（117.9 ℃）相對較高，但乙酸介電常數較小，在20 ℃時只有6.2，2 ℃時只有4.1，較小的介電常數使溶質在其中較難解離；同時乙酸與N-乙酰神經氨酸在溶液中帶有相同的電荷，帶有相同電荷的離子在溶液中不可能聚集，只有相互排斥。另外乙酸能夠與水以任意比互溶，且N-乙酰神經氨酸也是一種水溶性溶劑，在水中溶解度較大，而N-乙酰神經氨酸在乙酸中溶解度卻較小。以上性質顯示，且試驗結果也證實，乙酸是一種優良的結晶提純N-乙酰神經氨酸的溶劑。

確定了結晶溶劑，進一步對乙酸結晶提純的條件進行了研究，首先對濃縮液進行濃縮，濃縮后加入不同體積的乙酸進行結晶。結果表明，當加入1～3倍體積的乙酸時，均未出現結晶；而加入4～7倍體積的乙酸時，均出現了結晶。在4倍體積乙酸條件下，結晶后N-乙酰神經氨酸純度達68.9%，然而N-乙酰神經氨酸的純度并不隨乙酸體積的增加而明顯變化。因此，選擇4倍體積乙酸來進行結晶。

2.3 重結晶

把純度60.0%～70.0%的晶體進行重結晶。首先把晶體溶于水中，配成濃度200 g/L的水溶液，然后加入4倍體積的乙酸，低溫結晶。晶體用無水乙醇洗滌，然后烘干檢測。結果顯示，重結晶后N-乙酰神經氨酸純度均提高到96.0%以上（表1）。

2.4 N-乙酰神經氨酸的分離提純工藝流程

對枯草芽孢桿菌5 L罐發酵108 h，發酵液中N-乙酰神經氨酸含量為8.6 g/L左右，根據試驗結果設計了N-乙酰神經氨酸的提取工藝流程（圖1）。

對發酵液經該工藝流程處理，最后所得N-乙酰神經氨酸成品，經測定純度均在96.0%以上。

3 結論

由該研究構建的整合性枯草芽孢桿菌經發酵培養得到的N-乙酰神經氨酸發酵液含N-乙酰神經氨酸8～10 g/L，對該發酵液進行菌液分離、脫色、除雜除蛋白、濃縮、結晶、重結晶等分離提純后，可得到純度96.0%以上的N-乙酰神經氨酸結晶樣品，為大規模發酵產N-乙酰神經氨酸的分離提純提供技術方法，為枯草芽孢桿菌生產的N-乙酰神經氨酸的應用奠定基礎。

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