環(huán)境因素對楊梅葉原花色素的穩(wěn)定性影響

過塵杰　傅瑜

摘 要：楊梅葉原花色素有良好的抗氧化活性，具有作為功能性成分應用于化妝品、醫(yī)藥與食品領域的可能性。本文主要研究環(huán)境因素中的光照、溫度、pH和金屬離子對楊梅葉原花色素穩(wěn)定性的影響，對楊梅葉原花色素的實際應用進行初步探究。通過設計不同環(huán)境因素的對照試驗，利用香草醛-硫酸法測定原花色素含量的變化，以此為依據(jù)對穩(wěn)定性進行研究。結果發(fā)現(xiàn)，外界條件中，自然光、D65（人工日光）和UV（紫外光）光源會一定程度上降低穩(wěn)定性；60℃以下的溫度在短時間內對穩(wěn)定性幾乎沒有影響；在pH值為4.3～8.0范圍內，楊梅葉原花色素趨于穩(wěn)定；楊梅葉原花色素對Cu2+、Fe2+、Mg2+、Pb2+這四種常見金屬離子十分敏感。因此，楊梅葉原花色素若要作為功能性成分應用于工業(yè)生產(chǎn)，如下的環(huán)境條件有利于保持其穩(wěn)定性：避光，60℃以下的溫度，pH值為4.3～8.0范圍內，避免Cu2+、Fe2+、Mg2+、Pb2+這四種金屬離子。

關鍵詞：楊梅葉；原花色素；穩(wěn)定性

1 背景

楊梅（Myrica rubra Sieb. et Zucc）是我國的特色果樹之一，枝葉繁茂，但其研究多以鮮果加工為主，每年都有大量的楊梅葉被修剪丟棄。實際上，楊梅葉中含多種酚類化合物，主要由黃酮類化合物及原花色素類化合物組成，加以提取利用，可以變廢為寶[ 1 ]。

原花色素（Proanthocyanidins）具有良好的抗氧化活性，可以通過清除自由基、螯合金屬離子、調節(jié)酶活性等方式達到調節(jié)生理功能的效果。原花色素對美容與皮膚保健的作用也是十分顯著的[ 2-4 ]。

原花色素的的穩(wěn)定性容易受到光照、溫度、pH、金屬離子等環(huán)境因素的影響。目前有關楊梅葉原花色素的研究報道極少，對其穩(wěn)定性方面的研究也較少。原花色素易被氧化，常用于提高其穩(wěn)定性的物質主要有VC等抗氧化劑，在加工和貯藏過程中研究原花色素變化規(guī)律保持其穩(wěn)定性至關重要[ 5 ]。

本文主要研究光照、溫度、pH、金屬離子等環(huán)境因素對楊梅葉原花色素穩(wěn)定性的影響，通過各個影響因素的不同處理，香草醛-硫酸法測定原花色素含量的變化，以此為依據(jù)對穩(wěn)定性進行研究。

2 材料與方法

2.1 實驗儀器

層析柱：Sephadex LH-20，300 × 25 mm，GE Healthcare Bio-Sciences AB（Sweden）；

冷凍干燥機：LABCONCO，美國；

紫外-可見光分光光度計：UV-2550，日本島津；

標準光源箱：Tilo標準光源箱，深圳市天友利標準光源有限公司。

2.2 實驗試劑

丙酮，甲醇，正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，乙醇，1%（w/v）香草醛甲醇溶液，20%（v/v）硫酸甲醇溶液，檸檬酸，氫氧化鉀，硫酸鎂，硫酸亞鐵，醋酸銅，醋酸鉛等。

2.3 實驗方法

2.3.1楊梅葉原花色素的制備

楊梅葉粉末用70%（v/v）的丙酮溶液浸提4h，40℃旋轉蒸發(fā)除去丙酮，再用等體積正己烷和二氯甲烷萃取，以去除色素，脂肪和其他非酚類物質后。萃取后所得水相旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑并濃縮后冷凍干燥，得到楊梅葉原花色素粗提物。

稱取5g原花色素粗提物溶解在50%甲醇溶液中，上樣于層析柱。依次用50%甲醇洗脫去除糖類物質，90%甲醇洗脫去除大部分黃酮類物質，50%丙酮洗脫得到原花色素類物質。將50%丙酮洗脫得到的餾分經(jīng)旋轉蒸發(fā)除去丙酮后冷凍干燥[ 7 ]，即得到實驗所需的楊梅葉原花色素。

2.3.2光照對楊梅葉原花色素穩(wěn)定性的影響

研究避光、自然散射光、D65光源、UV光源4種光照條件對楊梅葉原花色素穩(wěn)定性的影響。首先，配制0.5 mg/mL 的楊梅葉原花色素溶液，裝入透光性良好的玻璃試管中密封。分別置于暗室（避光）、室內（避免陽光直射）、標準光源箱（D65/UV）內，分別經(jīng)過24h、72h后取出測定原花色素含量，之后每3d測定一次，直到第15d，每次測定做3次平行[ 8 ]。

2.3.3 溫度對楊梅葉原花色素穩(wěn)定性的影響

配制0.5 mg/mL 的楊梅葉原花色素溶液 50mL，等量裝入帶塞試管中，將它們分別置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴條件下，保溫處理2h后測定原花色素含量，平行測定3次，取平均值[ 8 ]。

2.3.4 pH對原花色素穩(wěn)定性的影響

配制0.5 mg/mL的楊梅葉原花色素溶液，于室溫下用0.1mol/L檸檬酸和0.1mol/L NaOH調節(jié)pH，配制成pH值分別為3.22、4.32、5.22、6.18、7.55、8.05、9.71的7組試液，于30℃恒溫水浴中靜置2h，測定各組原花色素含量，平行測定3次，取平均值[ 8 ]。

2.3.5 金屬離子對楊梅葉原花色素穩(wěn)定性的影響

配制0.5 mg/mL的楊梅葉原花色素溶液，Cu2+、Mg2+、Fe2+按照離子濃度分別為0.1、1.0、5.0和10.0mmol/L配制金屬離子鹽溶液，Pb2+則按照0.01、0.1、0.5和1.0mmol/L的濃度配制溶液，加入等量楊梅葉原花色素，于30℃恒溫水浴中靜置2h，測定原花色素含量，平行測定3次，取平均值[ 5 ]。

2.3.6原花色素含量測定

香草醛-硫酸法測定各個餾分的原花色素含量[ 9 ]。

用移液槍準確吸取2ml待測液（記錄2mg/mL），置于10ml 具塞試管中，加入2.5mL濃度為1%（w/v）的香草醛甲醇溶液，混勻后加入2.5ml濃度為20%（v/v）硫酸甲醇溶液，混勻，置于30 ℃水浴中反應15min，在500nm處測定吸光值。空白為2 mL甲醇，測定方法同上。樣品中原花色素含量以每克樣品（干重）中所含毫克當量（+）-兒茶素表示。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)分析，DPS進行數(shù)據(jù)分析。

3 結果與分析

3.1 光照對楊梅葉原花色素的穩(wěn)定性影響

由表1可知，避光條件下原花色素含量下降最慢，15d后原花色素含量為初始值的65.2%，UV照射下的原花色素在15d后剩余最少，僅為原來的22.8%，自然光與D65處理的樣品在15d后，分別剩下37.3%和31.3%。而且，實驗過程中發(fā)現(xiàn)，UV光源照射下的樣品在試管底部有沉淀生成，可能的原因是原花色素分子間發(fā)生聚合反應形成大分子，其分子量較大溶解度較小，從而生成沉淀，原花色素含量降低[ 5 ]。

觀察可知，15d中，置于暗室中的樣品其原花色素含量一直保持最高，自然散射光處理的樣品也一直比D65照射處理的樣品所含原花色素高，在6d之后，自然散射光與D65光源照射下的樣品的原花色素含量下降趨勢減緩，UV光源下的則從12d開始才有減緩趨勢，這與吳朝霞[ 10 ]、趙建國[ 5 ]的實驗結果相符。此外，根據(jù)以上變化趨勢可以判斷，雖然前9d中，自然光與D65處理的樣品所含原花色素都略低于UV處理的樣品，但從大概11d開始，UV照射處理的樣品所含的原花色素量是四個處理中最低的。

所以，楊梅葉原花色素在貯存時要注意避光，盡可能減小由光照造成的對其穩(wěn)定性的破壞。

3.2 溫度對楊梅葉原花色素的穩(wěn)定性影響

由圖1可知，80℃以內溫度對原花色素的穩(wěn)定性影響不大，這與李潤豐等人的實驗結果相符[ 11 ]。在30～60℃之間，各溫度對楊梅葉原花色素的穩(wěn)定性幾乎沒有影響，60℃之后，原花色素的含量開始有小幅度的下降，可能是由于原花色素的間苯二酚結構在熱作用下被破壞，無法與香草醛發(fā)生縮合反應，進而無法呈色，導致吸光度值降低。因此，在楊梅葉原花色素的加工利用過程中應盡量避免高溫，尤其是80℃以上的高溫。

3.3 pH對楊梅葉原花色素的穩(wěn)定性影響

由圖2可知，當pH在4.3～8.0范圍內時，原花色素的含量變化不大。楊梅葉原花色素溶液自身的pH為6.18，呈弱酸性。隨著酸度或堿度的增加，原花色素含量均有下降，當pH在4.3～8.0范圍外下降趨勢尤為明顯。由此可見，楊梅葉原花色素對酸堿比較敏感，在接近其本身pH值附近的范圍內比較安全，過酸或過堿都會導致原花色素含量的降低，這與張建立，李公春[ 12 ]的研究結果相一致。

3.4 金屬離子對楊梅葉原花色素的穩(wěn)定性影響

金屬離子對原花色素的影響巨大。

實驗中發(fā)現(xiàn)，加入1mmol/L的Cu2+溶液時，會即刻產(chǎn)生較多的棕黃色絮狀沉淀；

加入1mmol/L的Fe2+溶液時，會即刻產(chǎn)生大量的深藍色絮狀沉淀；

加入1mmol/L的Mg2+溶液時，無沉淀生成；

加入0.1mmol/L的Pb2+溶液時，會產(chǎn)生少量的白色沉淀。

添加四種金屬離子后，樣品的原花色素含量均大幅下降。分析以上現(xiàn)象的可能原因，由于黃酮類化合物分子中常含有酚輕基和γ-毗喃酮環(huán)，故常可與鋁鹽、鋯鹽、鉛鹽、鎂鹽、鐵鹽等試劑反應，生成有色絡合物[ 10 ]。

結合表2與實驗現(xiàn)象可知，加入這四種金屬離子溶液后，即使是所設置的系列濃度中濃度最低的金屬離子溶液，原花色素也會即刻被破壞，含量快速降低，接近于零。因此在原花色素的提取、精制和加工中應盡量避免Cu2+、Fe2+、Mg2+、Pb2+的存在。

4 小結

本文共研究了4個環(huán)境因素對楊梅葉原花色素穩(wěn)定性的影響。分析以上結果可知，避光條件下楊梅葉原花色素的穩(wěn)定性是最好的；60℃以下的溫度在短時間內對穩(wěn)定性幾乎沒有影響；在pH值為4.3～8.0范圍內，楊梅葉原花色素趨于穩(wěn)定；對于Cu2+、Fe2+、Mg2+、Pb2+這四種常見離子，楊梅葉原花色素都十分敏感。

楊梅葉原花色素的穩(wěn)定性受多方面因素的影響，本研究在盡可能控制其它變量相同的條件下單獨比較了各個影響因素的影響結果，但在實際中，需要將這些因素綜合考慮，以此達到提高楊梅葉原花色素穩(wěn)定性的目的，幫助楊梅葉原花色素可以更好的應用到實際的加工利用中。

楊梅樹在南方被大量種植，楊梅葉作為廢棄材料，來源廣，價格低，而且富含酚類物質，具有抗氧化、抗菌抗病毒等生物活性，是一種具有開發(fā)潛力的植物資源。

本文從開發(fā)利用楊梅葉的角度出發(fā)，提取楊梅葉中的原花色素，研究各類因素對其穩(wěn)定性的影響，為楊梅葉原花色素在化妝品、醫(yī)藥與食品領域的應用打下基礎。

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作者簡介：過塵杰（1990-），女，漢族，浙江紹興人，碩士，畢業(yè)于香港中文大學食品營養(yǎng)與科技專業(yè)，助教，主要從事食品營養(yǎng)、食品分析方面的研究。