硫化氫在番茄耐受鎘脅迫過程中的作用

程雙妮 葉迦寧 金東寧 桂雪琴 張彥潔 劉旦梅

摘要[目的]研究硫化氫（H2S）在番茄耐受鎘脅迫中的作用。[方法]采用5.0 mmol/L的鎘溶液配合H2S和H2S生成抑制劑來處理番茄幼苗，研究H2S在番茄幼苗耐受鎘脅迫的過程中對MDA、植物螯合肽編碼基因、金屬轉運蛋白編碼基因以及H2S生成基因表達的影響。[結果]鎘脅迫促進番茄幼苗根尖細胞的死亡，鎘濃度越高，其對番茄幼苗的氧化損傷越大；外源施加H2S會減輕鎘脅迫所產生的氧化脅迫；同鎘處理組相比，在同時施加H2S的處理組中，植物螯合肽編碼基因、金屬轉運蛋白編碼基因以及H2S生成基因的表達上調。 [結論] H2S可能通過提高植物螯合肽、金屬轉運蛋白以及H2S生成酶的表達來減輕重金屬對番茄幼苗的損害。

關鍵詞硫化氫；番茄；鎘脅迫

中圖分類號S601文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0140-04

Abstract[Objective] To study the function of hydrogen sulfide（H2S） in tomato under cadmium stress.[Method] We treated the tomato seedlings with cadmium solution （ 5.0 mmol/L） ， H2S and H2S generated inhibitors， then detected the content of MDA， as well as the expression levels of genes encoding andphytochelatins， metal transporters and the synthase of H2S. [Result] Cadmium promoted the death of cells in root tips of tomato seedlings， the degree of damage improved as the concentration of cadmium increased. The oxidative stress was alleviated when H2S was applied. The expression of genes encoding andphytochelatins， metal transporters and the synthase of H2S was upregulated when H2S was added to the treatments. [Conclusion] H2S can enhance the cadmium resistance of tomato seedlings by promoting the expression of andphytochelatins， metal transporters and the synthase of H2S.

Key wordsHydrogen sulfide；Tomato；Cadmium stress

基金項目國家自然科學基金青年基金項目（31501772）。

作者簡介

程雙妮（1985—），女，山西晉城人，本科生，專業：生物工程。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事植物分子生物學研究。

收稿日期2017-01-03

在生物體和細胞內存在著復雜多樣的信號途徑，在這些信號途徑中，用來在細胞間和細胞內傳遞信息的化學分子稱為信號分子。而在這些信號分子當中，氣體信號分子在動植物正常生理和抵御逆境反應中起著非常重要的作用，并且由于其具有可連續發生、迅速傳播以及快速彌散等特點而受到科學家們的廣泛關注[1]。硫化氫（H2S）是近年來發現的第3種氣體信號分子，雖然其研究起步較晚，但發展迅速[2]。人們發現在植物生長發育中，H2S能夠促進種子的萌發和不定根的生成[3-4]；提高光合效率，促進植物的生長發育[5]；還可以延長切花的觀賞期[6]。而在抵御非生物脅迫方面，H2S可以幫助植物抵抗干旱脅迫；增強植物對熱脅迫的耐受性[7-9] 。現代工業的發展，在給人類帶來大量便利的同時，也帶來了嚴重的環境污染。這其中，重金屬污染是危害較大的一類。在眾多重金屬當中，鎘（Cd）是土壤污染中具有較大毒性的一類。當植物生長在鎘污染的土壤中時，其生長發育會受到很大影響[10]。為應對重金屬脅迫，植物在進化過程中已經馴化出一套靈敏且復雜的處理機制，這其中包括：①通過金屬轉運蛋白來控制重金屬的轉入和外排[11]；②通過金屬硫蛋白和植物螯合肽的絡合作用來減輕重金屬的毒性[11-13]；③通過激活氧化還原系統來減輕重金屬脅迫帶來的氧化損傷[14-15]。已有研究表明，在植物遭遇重金屬脅迫的同時對植物外源施加H2S可減輕重金屬對植物的損傷[16]，但此類研究在番茄中鮮有報道。筆者通過H2S和Cd配合處理番茄幼苗，觀察幼苗的氧化損傷并檢測幼苗中H2S生成酶編碼基因、金屬轉運蛋白編碼基因以及植物螯合肽和金屬硫蛋白編碼基因的表達水平，探討了H2S在番茄耐受鎘脅迫過程中的作用。

1材料與方法

1.1材料

野生型番茄（Ailsa Criag）由番茄遺傳資源中心（加州大學戴維斯分校）提供，選用發芽后培養5 d的番茄幼苗作為試驗材料。番茄種子消毒過程如下：取適量種子置于20 mL離心管中，用1.5 mL 95%的乙醇洗2 min后倒去乙醇；加入1.5 mL 20%次氯酸鈉溶液（有效氯含量8%），搖床搖20 min；用無菌水清洗種子4～6次，每次清洗5 min；將消毒后的種子置于鋪有濕潤濾紙的培養皿里，然后置于培養間發芽。

1.2方法

1.2.1

脅迫處理。番茄種子消毒洗滌之后置于濕潤濾紙上發芽，待種子發芽后，轉移至含有1/2 Hoagland營養液的培養皿中生長5 d，挑選長勢一致的幼苗進行處理，用10 mL處理液（20 mmol/L CdCl2、100 μmol/L HT、1 mol/L NaHS，以及它們的稀釋液或組合液）替換培養皿中的培養液。其中H2S處理采用熏蒸法，即將NaHS母液至于小蓋子中并將該蓋子至于培養皿中完成H2S處理。所有處理進行24 h后取樣，分析數據。

1.2.2

MDA含量的測定。MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法測定。取0.15 g不同處理后的谷子幼苗，加入1.5 mL 5% TCA，研磨成漿，3 000 r/m離心5 min；取1 mL上清液，加1 mL 0.67% TBA沸水煮30 min，冷卻；取1 mL上清液，分別在波長450、532和600 nm 處測上清液的吸光值并計算 MDA濃度。MDA含量（μmol/g）=MDA濃度（μmol/L）×提取液體積（L）/植物組織鮮重（g）。

1.2.3

內源H2S產率的測定。稱取組織材料約0.2 g，按1〖DK〗∶10的比例加入提取液（0.05 mol/L PBS），充分研磨得到勻漿，4 ℃13 000 r/min離心10 min，取上清，用考馬斯亮藍法測定上清蛋白量；將L-Cys，Tris-HCl和DTT混合溶液置于小三角瓶中，放入加有500 μL的1%ZnAC的去蓋EP管，將蛋白粗提液加入反應液中；空白對照用提取樣液代替樣品勻漿，其余條件不變，置于37 ℃搖床120 r/min反應15 min；將小三角瓶中的EP管拿出，分別在離心管中先后加入20 mmol/L DPD和30 mmol/L FeCl3各100 μL，顛倒混勻，置于室溫暗處反應15 min；吸光度測定：在670 nm處測定吸光值，依據H2S產率標準曲線得到H2S濃度。H2S產率[nmol/（mg·min）]=H2S產生濃度（nmol/L）×0.7 L/[1.5 min×蛋白含量（mg）]。

1.2.4RNA提取和Real-time PCR。

取各處理中的番茄幼苗，利用RNAiso Plus試劑（TaKaRa）提取RNA，具體提取步驟按照試劑的使用說明。利用反轉錄試劑盒和Oligo（dT）進行反轉錄獲得cDNA。以番茄ACTIN基因作為內參，分析各處理中相關基因的表達變化。用于Real-time PCR的引物見表1。每個試驗重復3次，數據處理參見文獻[17]。

2結果與分析

2.1鎘脅迫對番茄幼苗的損傷分析

為研究鎘脅迫對番茄幼苗的影響，利用不同濃度的鎘來對番茄幼苗進行處理，并利用伊文思藍染色來觀察根尖細胞的死亡情況。結果表明，鎘會導致番茄根尖細胞的死亡，并且隨著鎘濃度的升高，伊文思藍染色越來越重（圖1），說明死亡細胞的數目越來越多。同時對不同濃度處理的MDA含量進行了測定，結果表明隨著鎘濃度的增加，各處理番茄幼苗的氧化損傷也逐漸加大（圖2）。鎘濃度為5.0 mmol/L時毒害作用已經很明顯，故后續試驗鎘濃度選擇5.0 mmol/L。

2.2H2S參與番茄幼苗對鎘脅迫的應答

為研究H2S在番茄幼苗耐受鎘脅迫中的作用，對不同濃度鎘處理下番茄幼苗中的H2S產率進行了分析。結果發現，隨著鎘濃度的升高，H2S產率也逐漸增高，說明當番茄幼苗面臨鎘脅迫時，H2S的生成被激發，暗示H2S參與番茄幼苗應答鎘脅迫的過程（圖3）。

2.3H2S緩解鎘脅迫對番茄幼苗的損傷

上一步的結果表明H2S可能在番茄耐受鎘脅迫過程中具有重要作用，為進一步證實此結論，利用外源H2S及其合成抑制劑HA同鎘一起處理番茄幼苗，并對番茄幼苗的氧化損傷程度進行了分析，結果表明H2S處理可顯著減輕番茄幼苗的氧化損傷程度，說明H2S可緩解鎘脅迫對番茄幼苗的損傷，但是鎘和H2S合成抑制劑HA一同處理時，幼苗的氧化損傷程度并沒有增加，這可能是因為HA只抑制了H2S的合成，但番茄幼苗體內原來存在的H2S還是在一定程度上起到了保護作用（圖4）。

2.4H2S緩解鎘脅迫的機理分析

為進一步解析H2S緩解鎘脅迫的分子機理，進一步對各處理中的植物螯合肽、金屬硫蛋白、金屬轉運相關蛋白以及H2S生成酶編碼基因的表達量進行了分析，結果表明：①鎘處理后，植物螯合肽蛋白編碼基因〖STBX〗SlPCS1的表達量明顯下調，而當用H2S處理以后，〖STBX〗SlPCS1的表達量得以恢復并上調表達（圖5）；②鎘處理之后，金屬轉運蛋白編碼基因〖STBX〗CEA、ZIP3和ZIP12的表達量不變或輕微上調，H2S處理以后，這些基因的表達量上調明顯，但配合HA一起處理時，這些基因皆下調表達（圖6）；③同金屬轉運蛋白一樣，鎘處理之后，番茄中的H2S生成酶編碼基因輕微上調，但加入H2S后，這些基因的表達量上調明顯，加入HA之后，這些基因的表達被顯著抑制（圖7）。上述結果表明，H2S可能通過調節番茄幼苗體內植物螯合肽、金屬轉運蛋白以及H2S生成酶的含量來幫助番茄幼苗抵御鎘脅迫。

3結果與討論

目前，重金屬污染已經成為污染耕地，影響農產品質量的一個重要因素，研究植物耐受重金屬脅迫的分子機理在生產上具有重要的應用價值。番茄作為一種具有經濟價值的模式雙子葉植物和茄科植物，有著遺傳背景清晰、遺傳轉化容易的特點，并且其基因組已被測序，所以在番茄中研究重金屬耐受機制，將為人們帶來更多的分子水平的信息，并且這些工作也為番茄育種奠定了基礎。

在該研究中，發現H2S在番茄耐受鎘脅迫的過程中具有減輕其損傷的作用，其作用機制可能是通過提高金屬螯合肽和金屬轉運蛋白的含量，加速鎘在植物體內的螯合和轉運速率，因而減輕重金屬對植物的毒害作用力。同時在H2S的生成過程中，可能存在一個正向反饋機制，即外源施加H2S會導致內源H2S的合成增多，進而加快H2S的解毒過程。

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