四川境內變電站RTV涂料絕緣子上藻類的分子系統學研究

周兵兵 白歡 李亞偉 張志霞 陳洪波 張星海 蘭利瓊 卿人韋

摘要[目的]對四川省境內變電站RTV涂料絕緣子表面藻類的生長情況進行了調研，并對其進行分子系統學分析。[方法]選取4個藻類生長比較典型的地點，對4地RTV涂料絕緣子上生長的藻類進行實地取樣，用光學顯微鏡對其形態進行初步鑒定，并進一步使用18S rDNA基因進行系統進化分析。[結果]通過顯微觀察發現，4地優勢藻類均為單細胞球狀綠藻；系統進化分析發現，雅安藻種屬于渡邊球藻分支，與Heterochlorella luteoviridis親緣關系較近，在MP、NJ和BI樹中的支持率分別為86%、79%、1.0，將其初步鑒定為Heterochlorella sp.SCYA1；廣安藻種屬于Elliptochloris，與Elliptochloris subsphaerica的18S rDNA序列堿基沒有差異，在MP、NJ和BI樹中的支持率分別為97%、99% 和1.0，故確認其為Elliptochloris subsphaerica SCGA8藻種；巴中和南充藻種都屬于柵藻屬，兩者親緣關系很近且序列只有2個堿基差異，MP、NJ和BI樹中的支持率比較高，分別為93%、 98% 和1.0，將其初步鑒定為Scenedesmus sp.SCBZ5和Scenedesmus sp.SCNC7。[結論]4地變電站RTV涂料絕緣子上的優勢藻種不全是同一種藻，生長于四川省境內RTV涂料絕緣子上的藻類具有多樣性。

關鍵詞RTV涂料；藻種純化；18S rDNA；系統進化分析

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0135-05

Abstract[Objective]The algaes growth on the surface of the insulators coated with RTV （room temperature vulcanized silicone rubber）at Sichuan Province was investigated ，the molecular systematics were analyzed.[Method]Several typical substations were selected.Algaes collected from the surface of the insulators located in those areas were used to explore species diversity.Those dominant algaes were separately purified by spread plate method.The morphology was identified by optical microscopy and the phylogenetic analysis of four monoclonal algaes were carried out based on 18S rRNA sequences.[Result]Those algaes were singlecelled globular algaes examined by light microscopy.Phylogenetic analysis indicated that the Ya′an dominant algae was identified as Heterochlorella sp.SCYA1，which was closely related to Heterochlorella luteoviridis.The support rates of the two species were 86%，79%，1.0 in MP，NJ and BI trees，respectively.The 18S rDNA sequence of Guang′an dominant algae was not different from that of Elliptochloris subsphaerica ，the support rates of the two species in the MP，NJ and BI trees were 97%，99% and 10，respectively，it was identified as Elliptochloris subsphaerica SCGA8.Both Bazhong and Nanchong dominant algaes belonged to Scenedesmus，which had close genetic relationship，they were identified as Scenedesmus sp.SCBZ5 and Scenedesmus sp.SCNC7.The 18S rDNA sequence of two species only had two base differences，their support rates in the MP，NJ and BI trees were 93%，98% and 1.0.[Conclusion]Results indicate that four dominant algaes are not the same kind，algaes growing on the surface of RTV coated insulators at Sichuan Province have species diversity.

Key wordsRTV coating；Purification of algae species；18S rDNA；Phylogenetic analysis

基金項目四川省電力科學研究院項目（13H1138）；四川省科技廳項目（2014JY0171）。

作者簡介周兵兵（1990—），男，甘肅天水人，碩士研究生，研究方向：藻類分類及資源利用。*通訊作者，副教授，博士，從事藻類學及能源微藻油脂代謝研究。

收稿日期2016-12-19

室溫硫化硅橡膠（Room Temperature Vulcanized Silicon Rubber，RTV）具有非常好的熱穩定性、電絕緣性、憎水性和憎水遷移性[1]，作為防污閃材料普遍應用于電力系統。在潮濕、污染比較嚴重的情況下，硅橡膠能夠有效地防止污閃的發生[2]。

雖然硅橡膠作為防污閃材料有許多優點，但是近年來，很多地區都出現了生物生長在硅橡膠絕緣子表面的現象。藻類是硅橡膠絕緣子上生長的主要微生物，尤其是熱帶地區[3]。Fernando等[4]報道了斯里蘭卡和坦桑尼亞33 kV輸變電設施RTV絕緣子上藻類的生長，這些藻主要生長在絕緣子表面。從斯里蘭卡硅橡膠絕緣子上分離得到的藻種經鑒定均為佐夫小球藻（Chlorella zonfingensis Dnz），這種藻主要分布在亞洲、澳洲以及歐洲，經常生長在樹干、巖石以及建筑物墻壁上。從坦桑尼亞硅橡膠絕緣子上分離得到的綠藻被鑒定為Apatococcus constipatus，屬于Chaetophraceae科，Leptosiroideae亞科，這種藻僅僅存在于非洲[5]。安置于新奧爾良西部沼澤的不同類型絕緣子上也發現有藻類和苔蘚等生物的生長[6]。在德國，Kunde等[7]觀察到使用7年之久的硅橡膠絕緣子上有生物的生長，這些生物由藻類和真菌組成，主要分布在絕緣子上較低的部位和絕緣子大小傘上表面邊沿。日本Yonezawa試驗點的聚合硅橡膠絕緣子經5年運行后，其上也發現有藻類的生長，這些藻存在于絕緣子相間間隔棒和套管上[8-9]。Sakata等[10]將絕緣子表面生長的藻鑒定為虛幻球藻（Apatococcus lobatus）。Dernfalk[11]在瑞典一個運行12年之久的11 kV配電系統的老化硅橡膠絕緣子上，也發現有嚴重的生物污染。這些硅橡膠絕緣子表面一部分被綠藻包被，一部分由地衣覆蓋。被生物污染的絕緣子表面相對比較粗糙，并且藻類和地衣在絕緣子上大多呈片狀分布[12]。目前，國外已經對絕緣子上生長的藻類做了很多研究工作，發現藻類的生長能影響絕緣子特性[13-16]，可以導致污閃事故發生，進而影響電路的正常運行。

我國地域遼闊，自然環境豐富多樣，但是藻類在我國輸變電設施硅橡膠絕緣子上的生長情況鮮有報道。通過對四川省境內進行調研，發現藻類在硅橡膠絕緣子上生長具有普遍性。選取4個比較典型的地區：雅安市、廣安市、巴中市和南充市，對4地變電站RTV涂料絕緣子、上生長的藻類進行采集、分離純化，并對4地藻種的18S rDNA基因進行克隆和分子系統學研究，初步確立這4地藻種的分類地位并為后續的研究提供理論基礎。

1材料與方法

1.1藻種及培養條件

2014年，藻種分別采自雅安市草壩220 kV變電站RTV涂料絕緣子、廣安市銅堡220 kV變電站RTV涂料絕緣子、巴中市110 kV信義變電站RTV絕緣子和南充市營山縣110 kV變電站RTV涂料絕緣子表面，采樣時，選取4 cm×4 cm的樣方，用藥勺刮取藻層，收集在無菌離心管中，將從各地采集的藻樣在滅菌后的BG11培養基[17]中培養，培養條件：溫度22 ℃，光照強度3 000 lx，光暗周期12 h〖DK〗∶12 h。

1.2形態觀察分別取30 μL各地藻液，制成水封片，在Olympus BH2顯微鏡下觀察并用測微尺測量細胞大小，Toup View拍照。

1.3藻種的分離純化取適量培養14 d左右的各地藻液，在血球計數板下計算細胞密度后將其稀釋成不同梯度，用涂布平板法[18]對各地優勢藻種進行純化。

1.44地藻種18S rDNA 基因的克隆

4地藻種總DNA的提取采用CTAB法[19]，用TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）檢測DNA濃度，-20 ℃保存待用。

用已知綠藻的18S rDNA基因序列，ClustalX 1.83[20]軟件進行多序列比對（Multiple Alignment），選擇保守區域，并用Primer Premier 5.0[21]軟件設計引物，得到1對引物：18S5F（5-AGGCCTACCATGGTGGTAACGG-3）； 18S7R（5-CCAGAACATCTAAGGGCATCAC-3）。對4地藻種18S rDNA進行擴增，PCR反應體系為25.00 μL，包含2.50 μL 10×Buffer，0.15 μL Taq DNA聚合酶（Vazyme，南京），2.50 μL dNTP（2.5 mmol/L），上下游引物各1.00 μL，2.00 μL DNA模板約50 ng，15.85 μL雙蒸水。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min；之后進行34個循環，每個循環包括94 ℃變性30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s；最后72 ℃總延伸10 min。PCR產物用SanPrep柱式膠回收試劑盒（Sangon，上海）純化后，連接到pMD19-T載體（TaKaRa，大連有限公司）。連接產物轉化到E.coli DH5α（Invitrogen，USA）感受態細胞中，經菌落PCR鑒定陽性克隆，所獲陽性克隆送華大基因技術有限公司測序。

1.54地藻種18S rDNA基因的分子系統學分析

在GenBank數據庫中下載一系列相關綠藻的18S rDNA基因序列（表1）。將從GenBank數據庫中獲得的已知綠藻的18S rDNA基因序列與克隆得到的4地藻種的18S rDNA基因序列一起構建分析數據庫，用ClustalX 1.83[20]對所構建的基因數據中的序列進行對位排列和多序列比對，在此基礎上進行相關的分子系統學分析。

45卷5期周兵兵等四川境內變電站RTV涂料絕緣子上藻類的分子系統學研究

1.5.1貝葉斯 （Bayesian Inference，BI）系統分析法。

運用 MrBayes v3.1.2[22]軟件，首先對數據進行模型和參數估計，以赤池信息量準則（Akaike Infomation Criterion，AIC ）[23]選擇出最佳堿基替代模型。2個并行程序分別以4條鏈（Markov Chain Monte Carlo，MCMC ）運行20 000 000代，每100代保留1棵樹。所得的樣本樹每1 000代的前20%作為老化樣本舍棄，剩余樣本樹采用50%多數一致性原則構建一致樹。最后通過后驗概率（Posterior Probability，PP）評估進化樹拓撲結構的可靠性。

1.5.2鄰位相接 （Neighbor-Joining，NJ） 系統分析法。

運用MEGA v.6.0[24]軟件，采用Kimura-2-parameter參數遺傳距離模型[25]，對系統發育樹的拓撲結構通過自展法（Bootstrap，BS）進行置信度檢測，自檢數據集為1 000。

1.5.3最大簡約 （Maximum Parsimony，MP） 系統分析法。

分析使用 PAUP* version 4.0 beta 10軟件[26]，以樹二重連接（Tree Bisectionreconnection）進行枝長變換；啟發式搜索（Heuristic Searches）進行1 000次隨機添加（Random Addition）重復；眾樹選擇（MulTrees Option） 獲取分支樹。同樣，通過自展法對進化樹拓撲結構進行置信度檢測，自檢數據集為1 000。

以上方法均以Pseudendocloniopsis botryoides、Desmochloris halophila和Halochlorococcum moorei作為外類群。

2結果與分析

2.14地RTV涂料絕緣子上藻類的生長情況

從圖1可看出，在4地各變電站RTV涂料絕緣子大、小傘的上表面均有藻類生長，藻類主要生長在未被小傘遮擋的大傘外表面，除雨水徑流過的地方（圖1B，箭頭所指）外，藻類的分布都較均勻；絕緣子小傘上藻類的生長較少，主要分布于小傘上表面外邊沿，且分布不均，呈零星片狀分布。在背光，水和塵埃不易附著的絕緣子大、小傘下表面均無藻類生長。從上往下，藻類在絕緣子表面的生長量逐漸增多。

2.24地RTV絕緣子上藻類的顯微觀察

該試驗分離的4地優勢藻種依采樣點分別命名為SCYA1（雅安藻種）、SCGA8（廣安藻種）、SCBZ5（巴中藻種）和SCNC7（南充藻種）。

SCYA1（圖2A）為單細胞球狀綠藻，細胞大小為4.0～90 μm； 成熟細胞葉綠體杯狀，1或2個，幼體細胞葉綠體大多紡錘形，無明顯蛋白核；無鞭毛，液體環境下不能運動。SCYA1形態學特征與異小球藻屬（Heterocholorella）較為相似。

SCGA8（圖2B）為單細胞，有時許多細胞暫時集聚在一起，細胞球形，細胞大小為4.5～13.0 μm；葉綠體軸生、星芒狀，充滿整個細胞，無明顯蛋白核；無鞭毛，液體環境下不能運動；營養繁殖為細胞分裂，分裂面多少與其細胞長軸垂直。SCGA8形態學特征與共球藻綱的Elliptochloris藻種類似。

SCBZ5（圖2C）和SCNC7（圖2D）均為單細胞球形，細胞大小為5.5～11.0 μm和5.0～11.0 μm；葉綠體片狀、周生，1個，具有1個蛋白核，細胞壁平滑、無刺；無鞭毛，液體環境下不能運動；在無性生殖過程中每個細胞產生2個橢球狀似親孢子，待母細胞壁破裂后子細胞被釋放出來，沒有觀察到有性生殖。SCBZ5、SCNC7形態學特征與柵藻屬（Scenedesmus）中球形藻種較為相似。

由于在光學顯微鏡下難以觀察到更細致的特征，因此僅依據形態學特征不能判斷以上藻種在分類學上的屬種位置。

2.3序列分析

通過PCR擴增獲得4地藻種18S rDNA基因序列長度為1 078 bp。與表1中各藻種18S rDNA基因多序列比對后，最終比對序列總長度為1 031 bp。在18S rDNA基因序列矩陣中，包含213個變異位點，163個簡約信息位點，分別占總位點的20.66%和15.81%。堿基含量差異不大，堿基T、C、A和G的平均含量分別為25.1%、20.6%、25.1%和29.2%。G+C 的含量（49.8%）和A+T 的含量（50.2%）基本相當。所測序藻種SCYA1的18S rDNA基因序列與黃綠異小球藻（Heterochlorella luteoviridis）、喜糖橢圓球藻（Chloroidium saccharophilum）、橢圓球藻（Chloroidium ellipsoideum）、腎形渡邊球藻（Watanabea reniformis）和弗雷德鮮綠球藻（Viridiella fridericiana）相同基因序列之間的相似性分別達96.29%、94.81%、94.63%、94.25% 和93.80%；藻種SCGA8的18S rDNA基因序列與Elliptochloris subsphaerica、Elliptochloris reniformis和Elliptochloris bilobata相同基因序列之間的相似性分別達100%、 99.32% 和99.16%；藻種SCBZ5和SCNC7的18S rDNA基因序列之間相似度達99.81%，只有2個堿基的差異，與Scenedesmus vacuolatus、Scenedesmus bijugus var.obtusiusculus、Scenedesmus rubescens和Scenedesmus acutus相同基因序列之間的相似性分別達99.63% 和9944%、99.07%和98.88%、98.88%和98.70%、98.70%和98.51%。這一高度的相似性進一步支持了形態學鑒定的結果。

2.4系統發育分析

用MP、NJ和BI法構建的系統樹的拓撲結構基本一致，如圖3所示。雅安變電站RTV絕緣子上的藻種在系統樹中位于渡邊球藻屬（Watanabea）分支，與黃綠異小球藻（Heterochlorella luteoviridis）聚為一簇，MP、NJ和BI樹中的支持率較高，分別為86%、79%、1.0，可以確定其為異小球藻屬的藻種，并初步鑒定為Heterochlorella sp.SCYA1；廣安RTV絕緣子上的藻種位于Elliptochloris屬分支， 與Elliptochloris subsphaerica堿基沒有差異，MP、NJ和BI樹中的支持率分別為97%、99% 和1.0，可以確認其為Elliptochloris subsphaerica SCGA8藻種。巴中和南充變電站RTV涂料絕緣子上藻在系統樹中都位于柵藻屬分支，且兩者親緣關系很近，MP、NJ和BI樹中的支持率比較高，分別為93%、98%和1.0。可以將這2種藻確認為柵藻屬藻種，將其分別鑒定為Scenedesmus sp.SCBZ5和Scenedesmus sp.SCNC7。

3結論與討論

該研究先采用傳統方法進行分離鑒定，再用現代分子生物學方法對4個藻種進行分析，這較大程度地保證了結果的準確性和客觀性。通過顯微觀察發現，雅安市草壩220 kV變電站、廣安市銅堡220 kV變電站、南充市營山縣110 kV變電站和巴中市110 kV信義變電站RTV涂料絕緣子上的優勢藻種形態特征雖有不同，但是在光學顯微鏡下很難確定這幾種藻分類學上的種屬位置。通過18S rDNA基因構建的系統發育樹發現，這幾種藻并非同一種藻，分屬不同類別。Heterochlorella sp.SCYA1為共球藻綱、渡邊球藻分支、異小球藻屬藻種；Elliptochloris subsphaerica SCGA8為共球藻綱Microthamniales目Elliptochloris屬藻種，而Scenedesmus sp.SCBZ5和Scenedesmus sp.SCNC7均屬于綠藻綱、環藻目、柵藻屬。

國外報道生長在硅橡膠絕緣子上的藻種有Chlorella zonfingensis Dnz、Apatococcus constipatus、Apatococcus lobatus，除了Apatococcus constipatus藻種的18S rDNA基因序列沒辦法獲取外，將其他2種藻的18S rDNA基因序列同樣用于系統進化樹的構建并判斷這2種藻是否與該研究中的藻種分類地位一致。經發現Chlorella zonfingensis Dnz藻種并非與Gubanski等[5]科學家鑒定的那樣，是小球藻科成員，而是該藻位于綠藻綱，與柵藻屬親緣關系相近（BI、NJ和MP樹中支持率分別為1.0、99%和99%）。近來年，Fucíkov等[27]根據該藻的分子和形態兩方面特征，重新定義了該藻，將其歸為環藻目、色球藻屬。這與該研究構建的系統進化樹中該藻種的分類地位相吻合。Sakata等[10]將Apatococcus lobatus鑒定為共球藻綱、小球藻科、虛幻球藻屬成員。在構建的系統發育樹中發現，該藻是共球藻綱成員，但并非小球藻科成員，獨立于小球藻科外，自成分支。由此可以看出，能夠在硅橡膠絕緣子上生長的藻并非一種，而是不同地方藻的種類有所不同，在我國四川境內各變電站絕緣子上生長的藻也不盡相同，這說明硅橡膠絕緣子上生長的藻種具有物種多樣性。

藻類是光能自養型生物，能夠利用CO2作為碳源合成有機物供藻細胞生長與繁殖。同時，光照、溫度、鹽度和水分等也是藻類生長和繁殖過程中不可缺少的生態因子。從已報道的藻類生長在硅橡膠絕緣子表面的地區來看，絕大多數處于熱帶亞熱帶地區[3-12]，而調查的雅安、廣安、南充和巴中4地都處于亞熱帶季風性濕潤氣候區，全年氣候適宜且極端天氣較少[28-31]。這幾個地方的光照和溫度都能滿足藻類在野生環境下生長，而空氣濕度成了絕緣子上藻類生長的主要限制因素。有機硅橡膠的表面張力非常小，水滴在材料表面形成的靜態接觸角較大[32-34]，噴淋試驗顯示：水在RTV硅橡膠涂料表面形成分離的水珠，而不是連續的水膜，這使得水在RTV涂料表面形成點狀聚集，減少了水分蒸發的面積，可以為藻類的生長提供一個潮濕環境，并為其提供生長所需的無機鹽類。與陶瓷或玻璃材料相比，RTV硅橡膠導熱系數更低，具有更好的絕熱性[35-37]。外界溫度的變化和太陽光持續的照射都不易使RTV硅橡膠表面溫度發生急劇變化，這可減緩絕緣子表面水分的蒸發，并為藻類提供一個相對適宜的生長環境。從藻類在4地RTV涂料絕緣子上的生長及分布情況可以看出，在背光、水分不易聚集的絕緣子大、小傘下表面沒有藻類的著生，被小傘遮擋的大傘上表面幾乎也沒有藻類的生長，這說明光合作用是藻類生長的基礎，而藻類受到光照強弱和接觸水分的多少對其光合作用效率影響很大。除此之外，藻類生命力非常強，可在逆境環境下通過自身代謝或者產生孢子等度過不良環境，而在條件適宜時可恢復生長，并快速繁殖形成新的藻落。綜合以上因素可以推斷出，藻類生長在野外RTV絕緣子表面是一種必然結果，且藻類在其上面的生長情況要比陶瓷或玻璃絕緣子上更好。藻類生長對絕緣子的使用壽命、電化學性質會產生影響，其產生的機理和影響的程度還需進一步探索。

綜上，該研究初步確定了四川境內雅安、廣安、巴中和南充變電站RTV涂料絕緣子上藻類的分類地位，這豐富了硅橡膠表面生長藻類的物種多樣性，也為探究我國其他地方絕緣子上藻類的生長與硅橡膠和藻類的生長關系提供一定的理論基礎。

參考文獻

[1] 陳洪波，鐘聰，何松.淺析RTV防污閃涂料在電力系統的應用[J].四川電力技術，2003，26（1）：39-40.

[2] KUMAGAI S.Influence of algal fouling on hydrophobicity and leakage current on silicone rubber[J].IEEE Transactions on Dielectrics & Electrical Insulation，2007，14（5）：1201-1206.

[3] CALLOW M E，CALLOW J A.Enhanced adhesion and chemoattraction of zoospores of the fouling alga enteromorpha to some foulrelease silicone elastomers[J].Biofouling，1998，13（2）：157-172.

[4] FERNANDO M A R M，GUBANSKI S M.Performance of nonceramic insulators under tropical field conditions[J].IEEE Transactions on Power Delivery，2000，15（1）：355-360.

[5] GUBANSKI S M，FERNANDO M A R M，PIETR S J，et al.Effects of biological contamination on insulator performance[C]∥Properties and applications of dielectric materials，2000.Proceedings of the 6th international conference on.Goteborg：Chalmers Univ.of Technol.，2000：797-801.

[6] MCAFEE R D，HEATON R D，KING J M，et al.A study of biological contaminants on high voltage porcelain insulators，I[J].Electric power systems research，1997，42（1）：35-39.

[7] KUNDE K，HENNING S R，KUHL M R，et al.New experience with composite insulators[R].Presented at Cigre，1998.

[8] JOSHO M，MIYAKAWA H，SAKATA M，et al.Long term field test of polymer insulators at the Yonezawa Test Site[C]∥IEEJ Transactions on HV.[s.l]：[s.n]，2001.

[9] Japanese utility studies composite insulators at longterm test station[R].In Insulator News and Market Report，2004：26-32.〖ZK）〗

[10] 〖ZK（#〗SAKATA M，MIYAKAWA H，UTSUMIAND Y，et al.Investigation of algae growth on surface of polymer insulators and hollow core insulators at the Yonezawa test station[C]∥Annual Meeting Record of IEE Japan.Japanese：[s.n.]，2001.

[11] DERNFALK A.Diagnostic methods for composite insulators with biological growth[M].Gteborg：Chalmers University of Technology，2004.

[12] WALLSTR M S，KARLSSON S.Biofilms on silicone rubber insulators； microbial composition and diagnostics of removal by use of ESEM/EDS：Composition of biofilms infecting silicone rubber insulators[J].Polymer degradation and stability，2004，85（2）：841-846.

[13] FLEMMING H C.Relevance of biofilms for the biodeterioration of surfaces of polymeric materials[J].Polymer degradation & stability，1998，59（1/2/3）：309-315.

[14] SUNDARARAJAN R，GRAVES J，MOHAMMED A，et al.Performance evaluation of polymeric insulators aged in lab and field[C]∥Power engineering society general meeting，2003，IEEE.[s.l.]：IEEE，2003.

[15] FERNANDO M A R M，GUBANSKI S M.Performance of nonceramic insulators under tropical field conditions[J].IEEE Transactions on Power Delivery，2000，15（1）：355-360.

[16] GAUTAM B K，MIZUNO Y，MATSUBAYASHI G，et al.Effect of wetting conditions on the contamination flashover voltages of polymer insulators[C]∥International conference on properties and applications of Dielectric Materials.[s.l.]：IEEE，2006：538-541.

[17] ALLEN M M，STANIER R Y.Growth and division of some unicellular bluegreen algae[J].Journal of general microbiology，1968，51：199-202.

[18] BUCK J D，CLEVERDON R C.The spread plate as a method for the enumeration of marine bacteria[J].Limnology & oceanography，1960，5（1）：78-80.

[19] ROGERS S O，BENDICH A J.Extraction of total cellular DNA from plants，algae and fungi[M].The Netherlands：Kluwer Academic Publishers，1994.

[20] JEANMOUGIN F，THOMPSON J D，GOUY M，et al.Multiple sequence alignment with CLUSTAL X[J].Trends in biochemical sciences，1998，23（10）：403-405.

[21] LALITHA S.Primer premier 5[J].Biotech software & internet report，2000，1（6）：270-272.

[22] RONQUIST F，HUELSENBECK J P.MrBayes 3：Bayesian phylogenetic inference under mixed models [J].Bioinformatics，2003，19（12）：1572-1574.

[23]AKAIKE H.A new look at the statistical model identification[J].Automatic Control IEEE Transactions on，1974，19（6）：716-723.

[24] TAMURA K，STECHER G，PETERSON D，et al.MEGA6：Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J].Molecular biology and evolution，2013，30（12）：2725-2729.

[25] SRIVATHSAN A，MEIER R.On the inappropriate use of Kimura2parameter （K2P） divergences in the DNAbarcoding literature[J].Cladistics，2012，28（2）：190-194.

[26] SIMONSEN T J，BROWN R L，SPERLING F A H.Tracing an invasion：Phylogeography of Cactoblastis cactorum（Lepidoptera：Pyralidae） in the United States Based on Mitochondrial DNA[J].Annals of the entomological society of America，2008，101（5）：899-905.

[27] FUC〖DD（-1〗ˇ〖DD）〗KOV K，LEWIS L A.Intersection of Chlorella，Muriella and Bracteacoccus：Resurrecting the genus Chromochloris KOL et CHODAT（Chlorophyceae，Chlorophyta）[J].Fottea，2012，12（1）：83-93.

[28] 吳澤，范廣洲，周定文，等.近60年“雅安天漏”變化特征分析[J].成都信息工程學院學報，2012，27（1）：63-70.

[29] 黎紅，熊華萍，李鵬，等.廣安市局地氣候對城區空氣質量影響研究[J].四川環境，2015，34（4）：97-104.

[30] 鮮鐵軍，翟園.1961～2014年南充市氣溫變化特征分析[J].安徽農業科學，2015，43（25）：213-214，217.

[31] 張雷，肖天貴，燕亞菲，等.四川巴中地區38年來氣候變化特征分析[J].成都信息工程學院學報，2010，25（3）：293-300.

[32] 蘇建軍，李杰，王學剛，等.RTV硅橡膠防污閃涂料研究現狀[J].山東電力技術，2015，42（1）：1-7.

[33] KIM S H，CHERNEY E A，HACKAM R.Suppression mechanism of leakage current on RTV coated porcelain and silicone rubber insulators[J].IEEE Transactions on Power Delivery，1991，6（4）：1549-1556.

[34] 吉翠萍，管延錦，張筱，等.室溫硫化硅橡膠防污閃涂料的研究進展[J].涂料工業，2015，45（11）：81-87.

[35] 楊棟，張煒，姜本正.硅橡膠基絕熱材料高溫熱行為研究[J].固體火箭技術，2012，35（3）：396-400.

[36] 潘大海，劉梅，孟巖，等.導熱絕緣室溫硫化硅橡膠的研制[J].橡膠工業，2004，51（9）：534-536.

[37] 韓雄煒.導熱硅橡膠的制備及性能[D].杭州：浙江大學，2006.