軟棗獼猴桃原生質體酶解液配方篩選

付鵬躍 劉德江 申健 呂明醫 梁雪瑩 董實偉 程海濤

摘要[目的]篩選軟棗獼猴桃原生質體最佳酶解液配方。[方法]以4種配方酶解液在相同條件下處理等量軟棗獼猴桃葉片，比較最后收集的純化原生質體量，篩選最佳酶解液配方。[結果]配方Ⅲ（1.0%纖維素酶、0.5%離析酶、0.3%果膠酶）和Ⅳ（1.0%纖維素酶、05%果膠酶）處理酶解效果要明顯優于配方 Ⅰ（2.0%纖維素酶、05%離析酶）、Ⅱ（2.0%纖維素酶、0.3%果膠酶）。[結論]配方Ⅲ（1.0%纖維素酶、05%離析酶、0.3%果膠酶）為軟棗獼猴桃原生質體最佳酶解液配方。

關鍵詞軟棗獼猴桃；原生質體；酶解；配方篩選

中圖分類號S603.6文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0133-02

Screening of Enzymatic Hydrolysate Formula of Actinidia arguta Protoplast

FU Pengyue，LIU Dejiang，SHEN Jian，CHENG Haitao* et al

（College of Life Sciences， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract[Objective]To screen the best enzymatic hydrolysate formula of Actinidia arguta protoplast. [Method]The leaves of A. arguta were treated with four enzymatic hydrolysate formula under the same conditions. The purified protoplast was collected and compared to screen the optimal enzymatic hydrolysate formula. [Result] The amount of protoplast collected by the solution of formula Ⅲ （1.0% cellulase， 0.5% segregation enzyme and 0.3% pectinase） and formula Ⅳ（1.0% cellulase，0.5% pectinase）were significantly higher than the solution of formulaⅠ（2.0% cellulase， 05% segregation enzyme） and formula Ⅱ（2.0% cellulase， 0.3% pectinase）.[Conclusion]Formula Ⅲ（1.0% cellulase， 0.5% segregation enzyme and 0.3% pectinase） is the best enzymatic hydrolysate formula for A. arguta protoplast.

Key wordsActinidia arguta；Protoplast；Enzymatic hydrolysis；Formula screening

基金項目黑龍江省大學生創新項目（201610222104）。

作者簡介付鵬躍（1993—），男，黑龍江肇源人，本科生，專業：生物科學。*通訊作者，副教授，碩士，從事植物資源學與生態學研究。

收稿日期2016-12-28

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）屬獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）多年生落葉木質藤本植物，俗名軟棗子、獼猴梨、藤瓜，是獼猴桃屬中在我國分布較為廣泛的野生果樹之一[1]，其主要分布在我國黑龍江、吉林、遼寧、河北、山西、山東、河南、安徽、浙江、云南等?。▍^）以及朝鮮、日本等國家，多生長在山坡灌木林中、溝邊、山頂雜木林中、山坡雜木林中。

我國對獼猴桃野生資源開展系統馴化和栽培有近50年的歷史[2]。從20世紀60年代初開始進行軟棗獼猴桃的選育，已選育出一批性狀優良的品種，如中國農業科學院特產研究所選育的品種‘魁綠和‘豐綠，中國農業科學院鄭州果樹研究所選育的全紅型品種‘天源紅，四川省自然資源科學研究院選育的‘寶貝星等[3-7]。相較于美味獼猴桃和中華獼猴桃品種，軟棗獼猴桃品種較少，無法滿足產業對品種多樣化的需求。加強軟棗獼猴桃新品種的研究，選育優良品種，對促進我國軟棗獼猴桃產業發展具有重要意義[8]。

原生質體（Protoplast）指通過質壁分離，能夠和細胞壁分開的那部分細胞物質[9]。目前原生質體培養已經在中華獼猴桃、美味獼猴桃以及毛花獼猴桃3個種中獲得成功，但對軟棗獼猴桃原生質體培養的研究少見報道[10]。該研究以4種配方的酶解液處理軟棗獼猴桃葉片，進行原生質體的酶解，旨在篩選出效果最為理想的酶解液配方。

1材料與方法

1.1材料

材料為軟棗獼猴桃瓶裝無菌苗葉片。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器。

JD500-3A分析天平（上海力衡儀器儀表有限公司）；筆式pH計（杭州盈傲儀器有限公司）；TD4臺式低速離心機（上海本昂科學儀器有限公司）。

1.2.2試劑。

纖維素酶（Cellulase Onozuke R-10，北京明陽科華生物科技有限公司）；離析酶（Macerozyme R-10，上海偉進生物科技有限公司）；果膠酶（Pectolyas Y-23，常州市海拓實驗儀器有限公司）；甘露醇。

1.3方法

1.3.1CPW培養基配制。

按照文獻[11]方法配制CPW培養基，具體配方如下：30 mg/L KH2PO4、100 mg/L KNO3、1 320 mg/L CaCl2·2H2O、250 mg/L MgSO4·7H2O。配制50 mL CPW培養基，調節pH為5.6～5.8，高溫滅菌后放入冰箱中保存待用。

1.3.2酶解液的制備。

試驗共設4種酶解液配方，具體配方見表1。取4個10 mL燒杯，在每個燒杯中倒入6 mL CPW培養基，再放入0.728 6 g甘露醇作為滲透壓穩定劑，調節pH至5.6，按照各組比例將纖維素酶、離析酶、果膠酶分別放入燒杯中，用CPW培養基定容到10 mL后充分搖勻，分裝到4個錐形瓶中進行標記。此次試驗葉片與酶解液質量比為1〖DK〗∶20。

1.3.3酶解試驗。

配制完酶解液后用分析天平稱量4份05 g葉片，將葉片剪碎到0.25 cm2左右，分別放入各組酶解液中充分搖勻，使每個碎片都浸沒在酶解液中。將錐形瓶放入低速搖床中進行黑暗處理，25 ℃，4～8 h。分別于1、4、8 h觀察記錄葉片樣品外觀與酶解液的變化情況。

1.3.4原生質體收集與稱重。

將錐形瓶中的葉片通過300目鋼篩進行過濾，收集到的濾液分裝入10 mL離心管中離心（300～500 r/min）5 min。離心后棄上清液，加入6 mL CPW培養基，再次離心（300～500 r/min）5 min。棄上清液后，將經過離心純化的各組原生質體稱重。

2結果與分析

2.1酶解1 h后觀察結果

由表2可知，處理1 h后，與配方 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ酶解情況相比，配方Ⅳ無明顯變化，配方Ⅲ與Ⅳ中可以清楚看到已經有部分葉片酶解出現了原生質體。配方 Ⅰ、Ⅱ 中的葉片無明顯改變，配方Ⅲ與Ⅳ中葉片已經有質壁分離的趨勢，葉片顏色開始變淺（圖1）。

錐形瓶中葉片顏色變淺，葉片變軟，葉片邊緣出現毛邊，酶解液較為清澈。配方Ⅲ與Ⅳ錐形瓶中葉片顏色變淺，葉片變軟，頂部有透明白膜，葉片有分離的趨勢，酶解液較為渾濁（表2）。

2.3酶解8 h后觀察結果

處理8 h后4種酶解液中葉片酶解情況見圖2。經觀察發現，配方 Ⅰ、Ⅱ 錐形瓶中葉片仍比較完整，具備一定形狀，葉片頂部出現白膜，輕輕晃動白膜仍未脫離，葉片邊緣有比較明顯的毛邊，酶解液比較渾濁，總體上來說酶解效果不理想（表2）。配方Ⅲ錐形瓶中葉片已無固定形狀，酶解液變為深綠色，肉眼可見大量綠色沉淀。配方Ⅳ錐形瓶中葉片也已經為游離態，但仍可見葉片碎片。

3結論

獼猴桃果富含豐富的VC、礦物質和花青苷等營養物質[12]，其主要營養成分位居水果的前列，且綜合經濟效益通常比一般水果高出3倍以上[13]。由于獼猴桃是新興果樹，對其遺傳育種的研究時間不長，對軟棗獼猴桃的研究更是有限，對原生質體分離工藝的篩選是對其進一步研究的基礎。該試驗以4種不同的酶解液配方篩選分離原生質體，試驗結果表明，配方Ⅲ（1.0%纖維素酶、0.5%離析酶、0.3%果膠酶）和Ⅳ（1.0%纖維素酶、0.5%果膠酶）酶解效果要明顯優于配方 Ⅰ （2.0%纖維素酶、0.5%離析酶）、Ⅱ （2.0%纖維素酶、0.3%果膠酶），但配方Ⅳ破碎較多。在供試酶解液中配方Ⅲ原生質體產量最多，破碎最少，所以配方Ⅲ應為軟棗獼猴桃原生質體最佳酶解液配方。

參考文獻

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