天山花楸化學成分的液質聯用分析

郁長治 郭小娜

摘要[目的]采用高效液相色譜-電噴霧質譜聯用技術識別天山花楸總黃酮類中的化學成分。[方法]反相C18色譜柱，以乙腈-0.3%甲酸為流動相，檢測波長360 nm，梯度洗脫。利用紫檢測器和電噴霧質譜負離子模式在線檢測化學成分，掃描范圍250～700 amu。通過此方法分析糖苷及其苷元。[結果]通過標準品對比及解析質譜，識別了7個化合物，分別為綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素3-O-己糖苷、槲皮素3-O-己糖苷丙二酸復合物、山奈素3-O-己糖苷、山奈素3-O-己糖苷丙二酸復合物。[結論]HPLC/ESI-MS2技術可準確迅速識別天山花楸黃酮類化合物，方法穩定可靠。

關鍵詞天山花楸；黃酮化合物；液質譜聯用

中圖分類號R284.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0111-03

Abstract[Objective] To analyze and identify the chemical compositions form total flavonoids of Sorbus tianshanica Rupr by HPLCESIMS. [Method] The analysis was processed by means of a reversed phase C18 column and binary mobile phase system consisting of acetonitrile -0.3% methanoic acid records 360 um by ultraviolet detector. The electrospray ionization mass spectrometry under negative ion modes was used to detect the chemical constituents. The full scan of ions ranged from 250-700 amu. Glycosides and aglycones were analyzed. [Result] 7 compounds were identified by standard comparison and analytical mass spectrometry， including 3caffeoylquinic acid， rutin， hyperin， quercetin3Ohexoside， quercetin glycoside 3O hexose malonic acid compound， kaempferol hexoside 3Ohexoside， kaempferol glycosides 3O hexose malonic acid compound. [Conclusion] HPLCESIMS can accurately and quickly identify the compositions of flavonoids in S. tianshanica， the method is stable and reliable.

Key wordsSorbus tianshanica Rup；Flavonoids；HPLC/ESIMS

作者簡介郁長治（1985—），男，新疆烏魯木齊人，藥師，碩士，從事藥物分析研究。*通訊作者，藥師，碩士，從事藥物分析及新劑型研究。

收稿日期2016-12-13

天山花楸（Sorbus tianschanica Rup）為花楸屬薔薇科植物[1]，具有悠久的民間用藥歷史[2]，具有改善心腦血液循環、降低血管阻力、依賴性地抑制心肌收縮和保護心肌缺血等[3]重要作用，在機體抗氧化[4-5]、鎮咳平喘方面也有顯著的效果。研究表明，天山花楸中主要化學成分有黃酮、甾醇、三萜等化合物[6]。目前，對天山花楸黃酮的測定方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、毛細管電泳法和高效液相法[7-8]，但這些方法無法對提取物中的未知化合物進行定性分析。近年來，多級質譜聯用技術廣泛應用于天然化合物的定性、定量分析[9]，可以快速確定未知成分[10]。筆者采用HPLC/ESI-MS2技術對天山花楸總提取物進行了分析，為明確天山花楸化合物組成提供了試驗基礎和依據。

1材料與方法

1.1試材

天山花楸提取物（自制）；蘆丁、綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、山奈素標準品（中國藥品生物制品檢定所）；乙腈、甲酸（色譜純）；高純水。

1.2儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀，色譜柱waters C18（4.6 mm×250 mm）；質譜儀AB/applied Biosystem.API4000，Analyst 1.42數據處理系統。

1.3方法

1.3.1樣品溶液制備。稱取天山花楸1 000 g，經60%乙醇超聲循環提取2次，濃縮后經AB-8大孔吸附樹脂柱用60%乙醇洗脫，冷凍干燥得粉末74 g。稱取天山花楸提取物10 mg，甲醇定容至25 mL容量瓶中，過0.22 μm微孔濾膜備用。標準品均用甲醇溶解，用0.22 μm濾膜過濾。

1.3.2色譜條件。梯度洗脫檢測波長360 nm；柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL。梯度洗脫條件見表1。

1.3.3質譜條件。采用ESI負離子掃描，掃描范圍為250～700 amu；碰撞氣流速5 psi，氣常流速20 psi，離子源電噴霧電壓為-4 500 V，離子源溫度650 ℃，霧化氣電流GS1 50 psi 、GS2 60 psi，去簇電壓DP為 -40 V、EP為-50 V，碰撞能量為-35 V，碰撞出口電壓為-6 V。使用氣體為N2。

1.3.4苷元分析。

天山花楸提取物在酸性條件下加熱水解。苷元經HPLC/ESI-MS2分析確定苷元類型。苷元的HPLC洗脫條件見表2。

2結果與分析

2.1苷元分析

由苷元HPLC圖（圖1）中樣品的保留時間可看出主要為2種苷元，通過HPLC/ESI-MS2并結合標準品比對（表3）可以確定2種苷元是槲皮素和山奈素。

2.2總離子流與色譜分析

天山花楸提取物HPLC色譜圖與其總離子流色譜圖吻合（圖2）。因黃酮類化合物具有較多羥基，可形成穩定的氧負離子，所以采用負離子檢測模式，使總離子流色譜圖有較低的信噪比。

2.3質譜解析

2.3.1化合物1。準分子離子峰m/z為352.8[M-H]-，針對m/z 352.8進行二級質譜掃描，出現m/z 190.9、160.8碎片離子，發現其與綠原酸的[M-H]-離子碎片的分子量十分吻合。2個離子碎片分別是綠原酸酯鍵斷裂后形成的阿魏酸m/z 190.9和奎寧酸m/z 160.8的離子碎片（表4）。最后通過標準品對比確定化合物1為綠原酸。

2.3.2

化合物2。準分子離子峰m/z為609.1[M-H]-，對m/z 609.1進行二級質譜掃描，出現m/z 300.0特征峰，并含有m/z 273.0、178.9、151.0特征碎片，可以認定這個是槲皮素離子，說明化合物2是以槲皮素為苷元的化合物。m/z 307.4離子碎片為槲皮素上的二糖結構（表4）。對比分子量、苷元與糖苷的組成發現，此化合物與蘆丁裂解規律一致。最后通過蘆丁對照品對比確定化合物2為蘆丁。

2.3.3

化合物3。準分子離子峰m/z為462.9[M-H]-。針對m/z 462.9進行二級質譜掃描，出現m/z 300.8特征峰，并且含有m/z 272.9、179.0、150.9特征碎片，參考化合物2可以斷定m/z 300.8是槲皮素離子；m/z 162.7離子碎片與六碳糖苷的分子量吻合（表4）。經對比分子量、苷元與糖苷的分子量與組成發現，此化合物與金絲桃苷的裂解規律十分吻合。最后通過金絲桃苷對照品對比，確定化合物3為金絲桃苷。

2.3.4化合物4。準分子離子峰m/z為463.1[M-H]-。針對m/z 463.1進行二級質譜掃描，得到m/z 300.0特征峰，并且含有m/z 273.0、179.0、150.8特征碎片，同化合物2可以斷定m/z 300.0是槲皮素離子，說明化合物4是以槲皮素為苷元的化合物。m/z 155.0離子峰的出現說明槲皮素苷元是按照RDA途徑I進行裂解，可以推斷m/z 161這個糖基是連接在槲皮素碳3位上（表4）。所以此化合物可以認為是槲皮素3-O-己糖苷。

2.3.5化合物5。準分子離子峰m/z為549.0[M-H]-。針對m/z 549.0進行二級質譜掃描，同樣得到了m/z 300.0的特征峰，并且含有m/z 271.0、179.0、150.6特征碎片，參考化合物2說明化合物5是以槲皮素為苷元的化合物；雖然未出現m/z 155.0、136.0等離子碎片，但按照槲皮素苷元與糖的連接特點可以認為糖的連接位置依然是槲皮素碳3位上。m/z 160.8為己糖離子。m/z 89.0為丙二酸的離子碎片，有文獻報道黃酮苷在進行質譜解析中會出現含有丙二酸的結構成分（表4）。所以此化合物推測是槲皮素3-O-己糖苷丙二酸復合物[11]。

2.3.6

化合物6。準分子離子峰m/z為447.0[M-H]-。針對m/z 447.0通過二級質譜掃描，得到m/z 283.8特征峰，并且找到了山奈素0、4位裂解的特征碎片m/z 177.8。由此可以斷定m/z 283.8是山奈素離子，說明化合物6是以山奈素為苷元的化合物。m/z 160.8為己糖離子（表4）。所以此化合物可以認為是山奈素3-O-己糖苷[12]。

2.3.7

化合物7。準分子離子峰m/z為533.2[M-H]-。針對m/z 533.2通過二級質譜掃描，出現m/z 285.0、1790，同化合物6可以斷定m/z 285.0是山奈素離子，該化合物是以山奈素為苷元的化合物。m/z 160.8為己糖離子，m/z 89.0為丙二酸（表4）。所以此化合物可以推測是山奈素3-O-己糖苷丙二酸復合物[13]。

3結論

運用HPLC/ESI-MS2對天山花楸粗提物中的化學成分進行了系統研究，對天山花楸提取物在負離子模式下的離子流圖中的化學成分進行了分析。結果表明，天山花楸化學成分主要為黃酮類化合物。根據不同化合物在質譜中的相對分子量、質譜碎片結構信息及色譜保留規律并加以標準品比對，成功鑒定了天山花楸中7個化合物，分別為綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素3-O-己糖苷、槲皮素3-O-己糖苷丙二酸復合物、山奈素3-O-己糖苷、山奈素3-O-己糖苷丙二酸復合物。

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