丙酮丁醇梭菌復合誘變及發酵廢棄物原料產生物丁醇的研究

毛碧飛,袁麗霞 陳祥松 孫立潔 朱微微 吳金勇 劉偉偉

摘要[目的]通過廢棄資源的再利用研究可替代的新型生物燃料——丁醇的發酵培養基。[方法]對菌株Clostridium acetobutylicum CGMCC 1.0134進行紫外誘變和磁場與Fe2+共同誘變，獲得1株丁醇產量高和穩定性好的優良突變株Clostridium acetobutylicum UM-80，采用不同的廢棄原料考察該突變菌株的發酵性能，并篩選出合適的性價比高的培養基。[結果]突變株UM-80發酵產丁醇和總溶劑（丙酮、丁醇、乙醇）分別為9.04、17.95 g/L，較原始菌株分別提高了5.12%、4.12%。單獨的蕨根是較好的丁醇發酵原料，當蕨根醪質量分數為15%時發酵液中丁醇濃度最高為5.50 g/L。當高山被孢霉與蕨根共同發酵時發酵液中丁醇最高產量為6.50 g/L。[結論]蕨根與高山被孢霉的復合培養基是較好的生物丁醇發酵培養基。

關鍵詞丙酮丁醇梭菌；復合誘變；廢棄物原料；丁醇

中圖分類號S216文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0001-03

Abstract[Objective] The aim was to study better fermentation medium for new type biofuel butanol through recycling waster resources.[Method] Clostridium acetobutylicum UM80， a mutant with high butanol yield and good stability， was obtained by ultraviolet mutagenesis and comutagenesis with Fe2+ by Clostridium acetobutylicum CGMCC 1.0134.Then the different fermentation materials were used to study the fermentation performance of the mutant strains， and the suitable medium with high cost performance was found out. [Result] The yield of butanol and total solvent （acetone， butanol， ethanol） were 9.04 and 17.95 g/L， respectively， which were 5.12% and 4.12% higher than those of the original strain. The fern root was the best raw material for the fermentation of butanol； when the mass fraction of fern root was 15%， the concentration of butanol in fermentation broth was 5.50 g/L. When the cofermentation of Mortierella alpina and fern root， the highest yield was 6.50 g/L.[Conclusion] The cofermentation of Mortierella alpina and fern root is better fermentation medium for butanol.

Key wordsClostridium acetobutylicum；Compound mutagenesis；Waste raw material；Butanol

基金項目合肥物質科學技術中心方向項目培育基金（2014FXCX006）；安徽省淮南市科技計劃項目（2014A15）；中國科學院合肥分院等離子體物理研究所科學基金（DSJJ-15-YY02）。

作者簡介毛碧飛（1991—），女，安徽銅陵人，碩士研究生，研究方向：微生物育種及發酵工藝。

通訊作者：袁麗霞，工程師，博士，從事生物質能源與開發利用研究；劉偉偉，副教授，博士，從事生物質能源與開發利用研究。

收稿日期2016-12-28

隨著化石燃料資源供給日益緊張以及人類環境保護意識的不斷提高，生物質成為全球優先發展的戰略[1]。乙醇被認為是一種可替代的燃料物質。除乙醇之外，丁醇被認為是另一種潛在的可替代的新型生物燃料，無論是燃燒值還是辛烷值，與汽油最為接近[2]。此外，丁醇還具備許多優于生物乙醇的特點，如親水性弱、腐蝕性小、便于管道輸送，且能與汽油任意比混合，無需對汽車發動機進行改造，將是替代汽油最理想的生物燃料。

近年來，由于人口增長、耕地減少、生物煉制行業迅速發展等因素的影響，糧食類原料的價格不斷攀升，導致丁醇發酵的生產成本大幅提高[3]。研究者采用多種非糧作物或農業廢棄物為原料進行丁醇發酵，包括木薯、玉米秸稈等[4]。筆者采用紫外和磁場與Fe2+共同誘變的復合誘變選育丙酮丁醇高產突變株，并探討了使用蕨根、蘋果渣、餐廚廢棄物進行發酵，同時在蕨根中添加高山被孢霉干菌體進行了共同發酵，以期尋找較好的替代原料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。菌株Clostridium acetobutylicum CGMCC 1.0134購自中國微生物菌種保藏中心。

1.1.2培養基。

PYG培養基：多胨5.0 g，胰胨5.0 g，酵母提取物10.0 g，葡萄糖10.0 g，鹽溶液40 mL（鹽溶液配方：CaCl2 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 10.0 g，NaHCO3 10.0 g，NaCl 2.0 g，蒸餾水1 L），蒸餾水960 mL，瓊脂5.0 g，pH 6.5～7.0，121 ℃滅菌20 min。

篩選培養基 Ⅰ：TYA培養基添加少量刃天青（氧化還原指示劑）。篩選培養基 Ⅱ：PYG培養基中的葡萄糖用可溶性淀粉替換，添加少量2-脫氧-D-葡萄糖[5]。

種子培養基：5%的玉米醪。發酵培養基：15%的玉米醪[6]。

1.2方法

1.2.1紫外誘變。

將培養48 h平板上的菌全部刮下，置于鋪滿玻璃珠的50 mL 0.9%生理鹽水中，得30 mL原始單孢子懸液。將單孢子懸液用0.9%生理鹽水或無菌水調整濃度為1.5×108個/mL。加3 mL單孢子懸液于直徑9 cm平皿中，開蓋置于15 W紫外燈30 cm處照射，在暗室邊攪拌邊照射0、90、180、270、360 s，用黑布包裹，置于黑暗處至少2 h。誘變結束后，用無菌水稀釋孢子懸液至濃度為1×10-5、1×10-6、1×10-7個/mL，混合均勻，每個濃度菌懸液各涂3塊平板，37 ℃培養5 d，統計菌落數并計算致死率[6]。

1.2.2磁場誘變和Fe2+共同誘變。

將培養48 h平板上的菌全部刮下，置于鋪滿玻璃珠的50 mL 0.9%生理鹽水中，得30 mL原始單孢子懸液。將單孢子懸液用0.9%生理鹽水或無菌水調整濃度為1.5×108個/mL。單孢子菌懸液分別加入0.001%、0.010%、0.050%、0.100%、1.000%的Fe2+溶液，置于0.5 T磁場中37 ℃搖床培養進行誘變。誘變結束后，用無菌水稀釋孢子懸液至濃度為1×10-5、1×10-6、1×10-7個/mL，每個濃度菌懸液各涂3塊平板，37 ℃培養5 d，統計菌落數并計算致死率。CK：菌懸液直接在37 ℃下厭氧培養3 d；CK1：菌懸液置于0.5 T磁場中3 h，然后置于37 ℃下厭氧培養3 d；CK2：向菌懸液分別加入質量分數為0001%、0010%、0.050%、0.100%、1.000%的Fe2+溶液，再置于05 T磁場中3 h，然后置于37 ℃厭氧培養3 d。

1.2.3高產突變菌株的可視化篩選。

在篩選培養基 Ⅰ 上進行初篩，將涂布后的平板倒置于厭氧培養箱中，37 ℃培養72 h，挑取生長較好的單菌落繼續培養，進行復篩。

1.2.4遺傳穩定性試驗。

將篩選得到的高產丁醇菌接到種子培養基中，37 ℃厭氧培養3 d作為F1代，然后連續繼代6次，得到F2、F3、F4、F5、F6、F7代，并且在繼代的同時將各代菌株接種到發酵培養基中，37 ℃厭氧培養72 h，采用氣相色譜測定發酵液中丙酮、丁醇和乙醇含量，根據測定結果判斷其穩定性。

1.2.5發酵液中溶劑及有機酸濃度測定方法。

采用氣相色譜測定。氣相色譜條件：色譜柱為安捷倫HP-INNOWAX，30 m×0.25 mm；檢測器為FID；N2為載氣，流速為35 mL/min，H2流速為30 mL/min，空氣流速為400 mL/min；初始柱溫為40 ℃，升至70 ℃，保留1 min，升至140 ℃，然后升至200 ℃；進樣口溫度為160 ℃；檢測器溫度為220 ℃；進樣量為0.4 μL，內標法定量[7]。

1.2.6發酵液殘糖測定。

采用SBA-40D生物傳感分析儀測定葡萄糖濃度。

1.2.7生物量測定。

采用TCA反復凍溶法測定。

1.2.8致死率計算。

致死率=誘變前活菌數-誘變后活菌數〖〗誘變前活菌數×100%

2結果與分析

2.1誘變及突變株的篩選

2.1.1紫外誘變劑量的選擇。

由圖1可知，紫外照射時間增加，菌體的致死率也隨之升高。在初期致死率升高較快，但在60 s之后，隨著照射時間的增加菌體致死率變化幅度逐漸下降。60 s時，致死率已達85.0%；150 s時，致死率達976%。根據經驗，致死率在80.0%～90.0%的處理效果較佳，所以選擇致死率為85.0%時的60 s作為處理時間。

2.1.2磁場與Fe2+共同誘變的劑量選擇。

由圖2可知，單獨的Fe2+對菌體生長有一定的抑制作用，但單獨的磁場對菌體無抑制作用。當磁場和Fe2+共同作用菌體時，對菌體生長有嚴重的抑制作用。由圖3可知，當Fe2+濃度達0050%時，致死率在850%以上。因此，以濃度0050%作為Fe2+誘變劑量。

2.1.3可視化篩選。

刃天青是氧化還原指示劑，通過刃天青的變色情況可以得到菌產還原力的情況，當菌產還原力強時刃天青呈無色，當菌產還原力弱時呈紅色。因為丙酮丁醇梭菌在生產丁醇的代謝途徑中需要還原力的參與，所以當菌產還原力的能力強時，可以間接判定菌的產丁醇能力強。同時刃天青培養基對菌株生長有抑制作用，試驗結果表明，050 g/L刃天青的添加量為其對菌株的最小抑制濃度，所以采用0.50 g/L刃天青對培養基進行菌初篩。2-脫氧-D葡萄糖（DOG）是淀粉的分解代謝阻遏物，若菌能在有2-脫氧-D葡萄糖的培養基中生長，說明菌克服了分解代謝阻遏，過量表達淀粉酶。試驗結果表明，2-脫氧-D葡萄糖010 g/L的添加量為其對菌株的最小抑制濃度，所以采用010 g/L 2-脫氧-D葡萄糖對培養基進行菌初篩。

2.1.4高產丁醇突變株的選育及突變株UM-80遺傳穩定性檢測。

出發菌株紫外誘變后經篩選培養基初篩和搖瓶發酵復篩后，獲得1株性能優良的突變株，命名為Clostridium acetobutylicum UM-80。在玉米醪發酵培養基中發酵72 h，丁醇產量為9.04 g/L，總溶劑產量為17.95 g/L。丁醇和總溶劑的產量較原始菌株分別提高了5.12%和4.12%。突變株UM-80經6次傳代獲得的7代菌株（F1～F7）發酵特性無明顯變化，說明該突變菌株遺傳穩定性好，適合進一步研究。

2.2高產突變株UM-80發酵培養基的優化

2.2.1種齡對發酵的影響。

由圖4可知，UM-80在24～42 h處于對數生長期，54 h菌體濃度達到最高，但在60 h時菌的濃度迅速下降，有可能是菌受到溶劑毒害，裂解死亡。接種時，選取36 h處于對數生長期的菌作為種液。

2.2.2蕨根醪初始濃度對發酵的影響。

調整蕨根醪初始濃度，其他成分不變，研究蕨根醪初始濃度對溶劑產量的影響。由圖5可知，當蕨根醪質量分數為15%時，發酵液中丁醇濃度最高，為5.50 g/L；當蕨根醪濃度低于15%時，發酵液丁醇產量較低，可以推測此時發酵液中碳源、氮源及其他營養物質不充分，發酵溶劑產量不高；當蕨根醪濃度大于15%時，丁醇產量開始下降，此時很可能是蕨根醪黏稠度增大，影響發酵液傳質過程。

2.2.3不同濃度高山被孢霉干菌體和蕨根醪對發酵的影響。

蕨根中含豐富的淀粉，但缺乏其他營養物質。高山被孢霉干菌體來自于中國科學院合肥物質科學研究院等離子體物理研究所實驗室發酵廢棄物，含有豐富的營養物質，包括蛋白質、油脂、其他生長因子等。該研究將高山被孢霉干菌

體添加到蕨根醪培養基中，考察其對發酵的影響。由圖6可知，當高山被孢霉干菌體濃度為0.60 g/L時，發酵液中丁醇濃度為6.50 g/L。當高山被孢霉干菌體的濃度在0～0.60 g/L時，發酵液中丁醇產量呈上升趨勢，可以發現高山被孢霉干菌體對于蕨根發酵丁醇的確有促進作用。當高山被孢霉干菌體的濃度高于0.60 g/L時，發酵液中丁醇濃度呈下降趨勢，推測可能是高山被孢霉中營養物質如氮源類濃度過高而無法被利用，并出現輕微抑制現象。

3結論

采用紫外線和磁場與Fe2+共同誘變的復合誘變丙酮丁醇梭菌，同時結合有效的篩選，選育出有良好遺傳穩定性的高產突變株UM-88。使用玉米醪作為發酵培養基時，丁醇和總溶劑產量分別為9.04和17.95 g/L。在使用不同濃度蕨根醪作為發酵培養基時，發現當蕨根醪質量分數為15%時，發酵液中丁醇濃度最高為5.50 g/L。當在質量分數為15%的蕨根醪中添加不同濃度高山被孢霉干菌體，高山被孢霉干菌體濃度為060 g/L時，發酵的最終丁醇產量最高為6.50 g/L。

由此可見，蕨根與高山被孢霉的復合培養基是很好的生物丁醇發酵培養基，且都是廢棄資源的再利用。

45卷5期毛碧飛等丙酮丁醇梭菌復合誘變及發酵廢棄物原料產生物丁醇的研究

參考文獻

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