吡喹酮及其主要代謝產物在草魚體內代謝動力學研究

朱鳳嬌 張洪玉 謝欣燕 胡鯤

摘要 [目的]研究吡喹酮及其主要代謝產物在草魚體內的代謝動力學規律。[方法]運用高效液相色譜法（HPLC），研究淡水草魚在單次口灌給藥10 mg/kg劑量條件下，魚體各組織中吡喹酮（PZQ）及吡喹酮一羥基代謝物（M1）的藥動學差異。[結果]草魚血漿、腸道、肝臟和腎臟內PZQ在各個時間點的藥物濃度存在極顯著差異（P<0.01）；PZQ在血漿、腸道、肝臟和腎臟的達峰時間分別為1.0、0.5、1.0和1.0 h，而藥物峰濃度為0.41、0.45、0.72和0.44 mg/L，M1在血漿、腸道、肝臟和腎臟的達峰時間分別為48.0、0.5、6.0和48.0 h，而藥物峰濃度為0.72、0.45、0.42和0.42 mg/g。這表明PZQ在草魚體內吸收分布快，M1的達峰時間滯后于PZQ。二者達峰濃度相似表明M1是PZQ在草魚體內主要代謝物。PZQ在血漿、腸道、肝臟和腎臟的消除半衰期（t1/2）分別為16.41、4.77、37.16和8.74 h，M1在血漿、腸道、肝臟和腎臟的消除半衰期（t1/2）分別為124、71、246和162 h，其消除半衰期明顯比PZQ長，說明在魚體中M1的殘留時間比PZQ更長。[結論]在實際生產中，應注意對M1的檢測。

關鍵詞 吡喹酮及其代謝產物；草魚；吸收；殘留；消除

中圖分類號 S941 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）06-0088-04

Pharmacokinetics Study on Praziquantel and Its Major Metabolites in Grass Crap

ZHU Feng-jiao，ZHANG Hong-yu，XIE Xin-yan，HU Kun* （National Pathogen Collection Centre for Aquatic Animals，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Abstract [Objective] To study the pharmacokinetics laws of parziguantel （PZQ） and its major metabolites in grass crap.[Method] Using high performance liquid chromatography （HPLC），the pharmacokinetics differences of PZQ and its major metabolite（M1）in each tissue of freshwater grass crap after oral administration with the dosage of 10 mg/kg were studied.[Result] There were significant differences of PZQ concentration in the plasma，intestinal tracts，liver and kidney of grass crap at different time points （P<0.01）.The peak concentration of PZQ in the plasma，intestinal tracts，liver，kidney of grass crap were 0.41、0.45、0.72 and 0.44 mg/L respectively and it reached peak concentrations at 1.0、0.5、1.0 and 1.0 h respectively.The peak concentration of M1 in the plasma，intestinal tracts，liver，kidney of grass crap were 0.72、0.45、0.42 and 0.42 mg/L respectively and it reached peak concentrations at 48.0、0.5、6.0 and 48.0 h respectively.These results showed that the absorption and distribution of PZQ was faster in grass carp and its peak time was earlier than M1.The peak concentration of PZQ and M1 were similar，which showed that M1 was major metabolite of PZQ in grass carp.The elimination half-life （t1/2） of PZQ in the plasma，intestinal tracts，liver，kidney of grass crap were 16.41、4.77、37.16 and 8.74 h respectively.And the elimination half-life of M1 in the plasma，intestinal tracts，liver，kidney of grass crap were 124、71、246 and 162 h respectively，which was significant longer than that of PZQ.These results indicated that the residual time of M1 in grass carp was longer than that of PZQ.[Conclusion] The residues of M1 should be detected in the actual production.

Key words Praziquantel and its metabolites； Grass crap； Absorption； Residue； Elimination

吡喹酮（Praziquantel，PZQ）是我國20世紀80年代初人工合成的吡嗪并異喹啉化合物，為無色或白色結晶性粉末，微溶于水，可溶于氯仿、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑[1]。目前，吡喹酮主要作為人和動物日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲、東畢血吸蟲病的首選藥物[1-3]，同時吡喹酮作為一種新型廣譜抗寄生蟲病藥物，對三代蟲、指環蟲、擬指環蟲都有很強的殺滅作用，且能有效治療由單殖吸蟲感染引起的魚體皮膚和鰓疾病[4-7]。由于其殺蟲效果顯著，吡喹酮已被廣泛應用于國內外水產養殖寄生蟲疾病的治療。目前，國內外關于吡喹酮的藥物代謝動力學研究主要集中于其在大鼠[8]、家兔[9]、絨山羊[10]、人體內的藥代動力學研究等[11]。在水產動物上的藥物代謝動力學研究并不多，集中于吡喹酮原型藥在虹鱒[12-13]、石斑魚[14]、草魚[15]中的藥物代謝動力學研究，而關于吡喹酮在水產動物體內的代謝產物的藥物代謝動力學研究較少。Diekmann等[16]對吡喹酮在小鼠肝臟代謝后的代謝產物進行了研究，發現吡喹酮代謝后被氧化成幾種不同的羥化產物。其中，一羥基代謝物（1個羥基環己基甲酰基取代吡喹酮胺）（簡稱M1）的含量最高。

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國重要的淡水經濟魚，其養殖分布范圍極廣。筆者以草魚為研究對象，以單次口灌10 mg/kg給藥的方式，研究給藥后不同時間草魚各組織中吡喹酮及其代謝產物的藥動學變化，旨在為指導其臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Aglient-1100型高效液相色譜儀配自動進樣器和熒光檢測器，為美國Aglient公司產品；漩渦混合器，為美國Thermo fisher公司產品；旋轉蒸發儀，為德國Eppendorf公司產品；精密電子天平（METTLER AB104-N）；高速冷凍離心機，為德國Eppendorf公司產品。

1.2 藥品與試劑

吡喹酮一羥基代謝物（M1）標準品（純度96.5%），由里海生物技術公司合成；吡喹酮標準品（純度為99.9%），購自Sigma-aldrich 公司；吡喹酮原料藥（純度為98%），購自河北峰華制藥有限公司；色譜純乙腈，購自德國默克公司；乙酸乙酯、乙醇、異丙醇和正己烷均為分析純，購自國藥化學試劑有限公司。

1.3 試驗動物

試驗所用草魚購自江蘇省南通國營農場，平均體重（80.0±6.8）g，對魚體表進行觀察，并進行解剖觀察。60條草魚暫養在水族箱（100 cm× 80 cm× 80 cm），試驗用水為充分曝氣的自來水，水溫控制在（15±1）℃，并使用增氧泵24 h充氧，暫養7 d。暫養期間每2 d換水1次，每次換水量1/3，早晚飼喂全價飼料，灌藥前1 d停止飼喂。

1.4 試驗方法

1.4.1 給藥和取樣。

試驗用鯽魚共50尾，每個時間點取5尾。用少量乙醇預溶吡喹酮原料藥，再用超純水定容配制成2 g/L口灌溶液，并加入少量食用色素使溶液呈紅色，以便觀察回吐情況。將試驗魚用套有塑料軟管的注射器以10 mg/kg的給藥劑量單次口灌吡喹酮溶液，無回吐者保留試驗。給藥前禁食24 h，給藥后6 h投餌，并在給藥后15和30 min以及1、3、6、12、24、48、96 h分別取血漿、肝臟、腸道、腎臟樣品，將取得樣品置于-80 ℃下保存。

1.4.2 樣品前處理方法。

將樣品從低溫冰箱取出，室溫解凍。取1 mL血漿或1 g組織勻漿置于15 mL離心管中，加入3 mL乙酸乙酯，漩渦振蕩3 min后4 500 r/min 離心10 min，取上清液置于另一干凈10 mL離心管；用3 mL乙酸乙酯重復提取1次后，合并上清液；45 ℃恒溫條件下旋轉蒸干，加1 mL流動相振蕩溶解3 min；再用1 mL正己烷去脂2次，取下清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后置于進樣瓶中，用高效液相色譜進行檢測。

1.4.3 色譜條件。

色譜柱為Agilent Zorbax XDB-C18 分析柱（4.6 mm×150 mm×5 μm）。流動相為乙腈∶水（V/V=50∶50） ；激發波長為265 nm，發射波長為280 nm；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量為20 μL。

1.4.4 吡喹酮及其代謝物標準溶液的配制和標準曲線的制備。

準確稱取吡喹酮標準品和吡喹酮一羥基代謝物（M1）標準品各0.01 g，分別用少量乙腈溶解后，用超純水定容至100 mL，配制成100 μg/mL標準儲備液，然后再用流動相分別稀釋成質量濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL共9個質量濃度梯度的標準溶液，使用HPLC儀分別測定其峰面積，然后分別繪制2種標準品的標準曲線，并求出回歸方程和相關系數。

1.4.5 數據處理。

使用藥動學程序軟件DAS 3.0進行各組織中藥代動力學模型擬合及參數計算，藥物消除的藥時曲線及藥物標準曲線使用Microsoft Excel 2013軟件繪制，使用SPSS 13.0統計軟件進行數據統計與分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線及檢測限

在設定的色譜條件下，使用高效液相色譜儀測定血漿和組織中吡喹酮及其一羥基代謝物（M1）的含量，色譜圖基線走動平穩，特異性強，重現性好（圖1）。吡喹酮（PZQ）及M1的標準溶液在0.05～20.00 μg/mL質量濃度范圍內呈線性關系，且線性關系良好，其回歸方程分別為y=0.142 4x+0.104 7（R2=0.999 9）和y=0.087 6x+0.177 9（R2=0.999 9）。以引起3倍極限噪音的藥量為最低檢測限，該方法的最低檢測限為0.05 μg/mL。

2.2 回收率和精密度

吡喹酮在草魚血漿、肝臟、腸道和腎臟內的回收率分別為81.4%～84.1%、80.8%～82.6%、85.5%～86.7%和 84.4%～85.8%，均能達到檢測要求。測得的血漿和樣品的日內相對標準偏差不大于5.07%，日間相對標準偏差不大于5.68%，均小于10%，符合精密度的測定要求。

2.3 吡喹酮及吡喹酮一羥基代謝產物在草魚體內的藥代動力學規律

在20 ℃水溫條件下，對草魚以10 mg/kg的劑量單次口灌吡喹酮后，吡喹酮（PZQ）及吡喹酮一羥基代謝產物（M1）在各組織中的藥時曲線見圖2，主要的藥物代謝動力學參數見表1。吡喹酮及吡喹酮一羥基代謝產物在淡水草魚血漿、腸道、肝臟和腎臟中符合一級吸收二室開放模型。

2.4 吡喹酮及吡喹酮一羥基代謝產物在草魚體內的濃度及分布特征

對草魚以10 mg/kg的劑量單次口灌吡喹酮后，吡喹酮（PZQ）及其一羥基代謝物（M1）在草魚體內各組織的藥時曲線見圖2。在草魚血漿中，PZQ和M1的達峰時間分別為1和48 h，腸道中PZQ和M1的達峰時間分別為0.5和0.5 h，肝臟中吡喹酮和M1的達峰時間分別為1和6 h，腎臟中PZQ和M1的達峰時間分別為1和48 h，說明吡喹酮代謝物的達峰時間幾乎都有所延遲。從圖2可以看出，草魚血漿中M1含量較其他組織高，血漿和腎臟的M1濃度在后半段時間維持在較高水平，腸道的M1濃度在前幾個時間點維持在較高水平，此后的消除規律與吡喹酮相似。

3 討論與結論

吡喹酮在水產養殖業中主要用作殺蟲劑，用于治療魚的寄生蟲疾病。由于該藥在水生生物體內吸收快、療效好、使用方便，其應用范圍被不斷拓寬，正逐漸成為一種常用的魚用殺蟲劑。為了規范養殖技術，控制因亂用殺蟲劑給水產品帶來的食用不安全性，吡喹酮在水產品殘留檢測中尤為重要。筆者在20 ℃條件下以10 mg/kg的劑量對淡水草魚單次口灌吡喹酮預混劑，對比吡喹酮及吡喹酮一羥基代謝產物的藥動學差異。結果表明，吡喹酮及吡喹酮一羥基代謝產物在草魚血漿、肌肉、肝臟和腎臟在各個時間點的藥物濃度存在極顯著差異（P<0.01）。

3.1 吡喹酮在草魚體內的藥動學特征

在對草魚口灌單劑量10 mg/kg吡喹酮后，吡喹酮在魚體內各組織的藥時數據均符合一級吸收二室開放模型，其血漿、腸道、肝臟和腎臟的達峰時間分別為1.0、0.5、1.0和1.0 h，而藥物峰濃度為0.41、0.45、0.72和0.44 mg/L，消除半衰期（t1/2）分別為16.41、4.77、37.16和8.74 h，表觀分布容積（V1/F）分別為22.82、31.54、26.47和39.50 L/kg，說明吡喹酮在草魚體內吸收快且分布廣泛。在對草魚口灌

單劑量10 mg/kg吡喹酮后，吡喹酮一羥基代謝物M1在魚體血漿、腸道、肝臟、腎臟內的藥時數據均符合一級吸收二室開放模型，其達峰時間分別為48.0、0.5、6.0和48.0 h，而藥物峰濃度為0.72、0.45、0.42和0.42 mg/g。謝欣燕等[15]在對草魚口灌單劑量500 mg/kg吡喹酮，草魚血漿的藥時數據符合二室模型，血漿中藥物在1 h時達到峰值（1.13 μg/mL），表明吡喹酮口服后吸收迅速且分布快，在體內有效濃度維持時間較長。該試驗結果與前人研究報道相一致，但是由于試驗的給藥劑量的不同，魚體內的藥物濃度水平也有一定差異。

3.2 吡喹酮在草魚體內的代謝情況

曾有學者運用放射性同位素技術研究吡喹酮在人體及實驗動物體內的代謝，結果發現吡喹酮會迅速被機體吸收，且大多數藥物在24 h后經尿液排出，以原藥形式從尿液排泄的不足口灌劑量的0.1%[16-18]。Bühring等[19]對吡喹酮在小鼠肝臟代謝后的代謝產物進行了研究，發現吡喹酮代謝后是被氧化成幾種不同的羥化產物，經過質譜分析，得到其結構式。其中，一羥基代謝物（M1）的含量最高。

在對草魚口灌單劑量10 mg/kg吡喹酮后，在草魚血漿中，吡喹酮及M1的達峰時間分別為1和48 h，肝臟中吡喹酮及M1的達峰時間分別為1和6 h，腸道中吡喹酮及M1的達峰時間分別為0.5和0.5 h，腎臟中吡喹酮及M1的達峰時間分別為1和48 h。除腸道外，吡喹酮代謝物在其他內臟內的達峰時間都延遲，可能是因為吡喹酮在組織中代謝需要經過一段時間，而腸道里藥物容易被排空，所以腸道的藥物滯留時間沒有其他組織長且濃度高。

吡喹酮及其代謝物在草魚血漿、肝臟、腸道和腎臟組織中均有分布，總殘留量從大到小依次為肝臟、腎臟、血漿、腸道，吡喹酮及其代謝物在肝臟中殘留量最高，消除速度最慢，因此初步推斷出肝臟是其殘留靶組織。草魚血漿中吡喹酮的峰濃度為0.41 μg/mL，代謝物M1的峰濃度為0.72 μg/mL，說明吡喹酮在草魚體內代謝成M1的能力很強，除腸道外，吡喹酮一羥基代謝產物在血漿、肝臟和腎臟各組織中的殘留量均大于吡喹酮。這說明吡喹酮原型藥可能不是吡喹酮在魚體內的殘留標示物。

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