超聲輔助提取酒糟類黑精的工藝研究

郝日禮 鄭佳佳 朱傳合

摘要 [目的]確定酒糟類黑精最佳超聲提取工藝參數(shù)。[方法]以酒糟為原料，采用單因素試驗、Plackett-Burman設(shè)計、最陡爬坡試驗及Box-Behnken設(shè)計進行超聲輔助酒糟類黑精提取工藝研究。[結(jié)果]試驗確定酒糟中類黑精的最佳條件為超聲時間23 min、超聲溫度55 ℃、pH 1.0、料液比1∶29（mg∶mL）、超聲功率540 W、顆粒直徑270 μm，該條件下酒糟中類黑精的提取率為66.92%。[結(jié)論]該研究可為類黑精的開發(fā)應用提供參考。

關(guān)鍵詞 酒糟；類黑精；超聲輔助提取

中圖分類號 TS261 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）06-0071-05

Optimization for Ultrasonic-assisted Extraction of Melanoidin from Vinasse

HAO Ri-li， ZHENG Jia-jia， ZHU Chuan-he*

（College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian， Shandong 271018）

Abstract [Objective] The ultrasonic-assisted extraction technology of melanoidin from vinasse was optimized.[Method] With vinasse as raw material， single factor test， Plackett-Burman design（PB）， the steepest ascent method and Box-Behnken design （BB） was used to establish the optimal processing.[Result]The optimal conditions were as followed： ultrasonic treatment of 23 min， ultrasonic treatment temperature 55 ℃， pH 1.0， ratio of material and liquor 1∶29（mg∶mL）， ultrasound power 540 W and particle diameter 270 μm.The extraction rate is 66.92%.[Conclusion] The study can lay a foundation for development and application of melanoidin.

Key words Vinasse；Melanoidin；Ultrasonic-assisted extraction

酒糟作為谷物中蒸出酒精或酒精飲料后的殘渣，常被作為家畜的飼料。我國白酒釀造行業(yè)每年產(chǎn)生大量酒糟，不僅利用率低而且?guī)碇T多環(huán)境問題。食品類黑精是指羰基化合物與帶有游離氨基的含氮化合物之間發(fā)生美拉德反應時后期形成的棕褐色大分子量聚合產(chǎn)物[1]。研究表明，食品類黑精具有一定的抗氧化、抗誘變、降糖、結(jié)合風味物質(zhì)的作用，另外還具有類似膳食纖維的功能[2]。傳統(tǒng)抗氧化劑因可能具致癌性被部分國家禁止使用，從天然產(chǎn)品中提取的類黑精可能成為安全替代品之一。白酒的高溫釀造過程中羰氨反應下類黑精的生成，為酒糟類黑精的提取研究奠定了基礎(chǔ)。

目前國內(nèi)外學者已對咖啡、李子干[3]、焙烤食品[4]、豆豉[5]、蜂蜜[6-7]、奶酪[8]、醬油[9-10]、甜葡萄酒[11]等真正褐色食品體系美拉德反應類黑精及其中間體進行了提取分離以及研究，但鮮有從酒糟中提取類黑精的技術(shù)研究。筆者以芝麻香型酒糟為原料，采用超聲輔助提取，通過測定清除羥基自由基的能力來確定酒糟類黑精的提取率，進而確定工藝參數(shù)，為類黑精的應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料及主要試劑。

芝麻香型酒糟由泰安生力源集團提供，60 ℃烘干、粉碎后過篩備用；乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備。

UV-2450紫外分光光度計，日本島津有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市華普達教學儀器有限公司；TDZ5-WS臺式低速離心機，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司；KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 類黑精提取率的測定。

清除羥基自由基的測定采用Fenton反應水楊酸法[12]，略有改動。

分別配制0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL抗壞血酸標準品標準溶液，測定其羥基自由基清除率，以羥基自由基清除率（Y）為縱坐標，抗壞血酸濃度（X）為橫坐標，得標準曲線的回歸方程：Y=384.06 x-5.471（R2=0.996 7）。

準確稱取酒糟干粉1.000 g，置于250 mL三角瓶中，加入溶劑混勻，在不同條件下提取，3 500 r/min離心15 min，取上清液定容待測。測定樣品液的羥自由基清除率，根據(jù)抗壞血酸標準曲線的回歸方程，計算酒糟類黑精的提取率。

酒糟類黑精提取率（%）=C×V×100/m式中，C為按照標準曲線計算出的類黑精的抗壞血酸質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為樣液體積（mL）；m為1 g酒糟完全提取時抗壞血酸的質(zhì)量（g）。

1.2.2 酒糟類黑精提取工藝參數(shù)的優(yōu)化。

以乙醇濃度、超聲時間、超聲功率、超聲溫度、料液比（mg∶mL）、顆粒度、pH為考察對象，采用單因素試驗、Plackett-Burman（PB）試驗、最陡爬坡試驗及Box-Behnken（BB）試驗，獲取最適工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對類黑精提取率的影響。

在料液比1∶20、超聲功率300 W、超聲時間30 min、超聲溫度30 ℃、顆粒直徑380 μm的條件下，考察不同濃度乙醇對類黑精提取率的影響。由圖1可見，提取率隨著乙醇濃度的增大明顯減小，當采用無水乙醇提取時提取率小于5%，這可能是該物質(zhì)醇溶性較低導致。因此，選擇水作為提取溶劑。

2.1.2 超聲時間對類黑精提取率的影響。

當料液比為1∶20、超聲功率300 W、超聲溫度30 ℃、顆粒直徑380 μm時，考察不同超聲時間處理對類黑精提取率的影響。由圖2可知，隨著超聲時間的延長，提取率呈現(xiàn)出上升的趨勢，并且在30 min時間范圍內(nèi)迅速升高，在30 min后增幅變緩，趨于穩(wěn)定。由此，確定超聲時間為30 min。

2.1.3 料液比對類黑精提取率的影響。

在超聲時間30 min、超聲功率300 W、超聲溫度30 ℃、顆粒直徑380 μm條件下，考察不同料液比對類黑精提取率的影響。由圖3可知，類黑精提取率隨料液比中溶劑用量的增大呈現(xiàn)上升趨勢，但1∶25后上升趨勢不明顯。本著經(jīng)濟的原則，選擇1∶25為進一步試驗條件。

2.1.4 顆粒度對類黑精提取率的影響。

在料液比1∶25、超聲溫度30 ℃、超聲時間30 min、超聲功率300 W的條件下，研究不同顆粒直徑（380、270、250、212、160 μm即40、50、60、70、90目）對類黑精提取率的影響。由圖4可以看出，當顆粒直徑小于270 μm，其對酒糟類黑精提取率的影響不顯著（P<0.05），故選取顆粒直徑270 μm進行后續(xù)試驗。

2.1.5 超聲功率對類黑精提取率的影響。

在料液比1∶25、超聲溫度30 ℃、超聲時間30 min、顆粒直徑270 μm條件下，研究不同超聲功率對類黑精提取率的影響。

由圖5可以看出，當功率增加時，類黑精的提取率相應增加，當功率達到540 W時出現(xiàn)最高值，而后有所下降。分析原因，低功率超聲的空化作用對類黑精的提取有利，高功率則對其結(jié)構(gòu)造成破壞。同時，比較超聲處理和未超聲處理（0 W）的提取率發(fā)現(xiàn)，浸泡提取率僅為28.2%，超聲輔助提取極大地提高了類黑精提取率。

2.1.6 超聲溫度對類黑精提取率的影響。

在料液比1∶25、超聲時間30 min、超聲功率540 W、顆粒直徑270 μm的條件下，研究不同超聲溫度對類黑精提取率的影響。由圖6可見，類黑精的提取率隨著浸提溫度的增加有所提高，在60 ℃時達到最大值，故選取60 ℃作為進一步提取溫度。

2.1.7 pH對類黑精提取率的影響。

在料液比1∶25、超聲時間30 min、超聲功率540 W、超聲溫度60 ℃、顆粒直徑270 μm的條件下，考察不同pH對類黑精提取率的影響。由圖7可知，隨著pH的提高，類黑精的提取率呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢?？紤]到堿性環(huán)境對類黑精易造成破壞，故選擇pH 2.0作為提取條件。

2.2 PB試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選用n=12，中心點數(shù)為3的PB設(shè)計，對超聲時間（X1）、超聲溫度（X2）、pH（X3）、料液比（X4）及顆粒度（X5）5個因素進行考察，試驗設(shè)計見表1，結(jié)果見表2。

采用Minitab15軟件對表2中試驗結(jié)果進行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗，回歸模型的P<0.001（P<0.05），決定系數(shù)R2為87.75%，說明回歸方程擬合良好，其顯著性分析結(jié)果見表3。

表3中顯著性分析表明超聲時間、超聲溫度、pH、料液比P值均小于0.05，為影響酒糟類黑精提取率的顯著因子，作為進一步考察因素；而顆粒度為不顯著因子。影響顯著的因素中，按其影響由大到小分別為超聲時間、超聲溫度、pH、料液比；其中超聲時間、超聲溫度和pH系數(shù)為負數(shù)，說明在該試驗所選擇的范圍內(nèi)響應值隨其增大而減?。涣弦罕认禂?shù)為正值，表明料液比處于高水平時響應值相對較大。

2.3 最陡爬坡試驗

以PB試驗確定的顯著因素為爬坡試驗的因素，用各顯著因素的正負效應確定最陡爬坡試驗的路徑（包括變化方向和變化步長），進行最陡爬坡試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

由表4可知，在3號試驗處達到最高點，該點對應的條件值為超聲時間21 min、超聲溫度54 ℃、pH 1.1、料液比1∶28。

2.4 BB試驗

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，采用響應面設(shè)計，運用BB中心組合試驗設(shè)計原理[13]，選擇對酒糟類黑精提取率影響顯著的4個因素，超聲時間（X1）、超聲溫度（X2）、pH（X3）和料液比（X4）為自變量，以類黑精提取率（Y）為因變量，做4因素3水平BB試驗，試驗設(shè)計見表5，結(jié)果見表6。

2.4.1 參數(shù)分析。

利用SAS 8.0軟件對表6中BB試驗設(shè)計結(jié)果進行回歸分析，并對模型系數(shù)進行顯著性檢驗，結(jié)果得出，

FX1=25.110 01，PX1=0.000 304；

FX2=20.986 23，PX2=0.000 631；

FX3=0.002 434，PX3=0.961 464；

FX4=45.586 76，PX4=0.000 1；

FX21=29.577 89，PX21=0.000 15；

FX1X2=2.254 442，PX1X2=0.159 079；

FX1X3=5.493 276，PX1X3=0.037 13；

FX1X4=4.408 449，PX1X4=0.057 583；

FX22=34.108 88，PX22=0.000 1；

FX2X3=0.838 207，PX2X3=0.377 941；

FX2X4=0.005 365，PX2X4=0.942 82；

FX23=23.763 01，PX23=0.000 382；

FX3X4=5.379 429，PX3X4=0.038 812；

FX24=11.958 61，PX24=0.004 734；

F模型=11.644 47，P模型=0.000 1；

F線性=22.921 36，P線性=0.000 1；

F二次項=13.239 49，P二次項=0.000 234；

F交叉乘積=3.063 195，P交叉乘積=0.046 786；

F失擬項=15.992 16，P失擬項=0.060 251。

由此表明二次多項式具有高度的顯著性；失擬項P=0.060 251>0.05，不顯著；CV=0.631 825<10；同時，模型的R2=93.14%，表明試驗數(shù)據(jù)與回歸數(shù)學模型擬合性良好[14]，上述模型可較好地預測各指標實際值。

根據(jù)P值檢驗各模型系數(shù)的顯著性，同時也可反映變量之間交互作用大小，P值越小越顯著。表明，一次項和二次項對提取率的影響極顯著（P<0.01），交互項顯著（P<0.05）。超聲時間（X1）、超聲溫度（X2）和料液比（X4）對酒糟類黑精的線性效應皆極顯著，pH（X3）不顯著；各因素影響由大到小分別是：料液比（X4）、超聲時間（X1）、超聲溫度（X2）、pH（X3）。交互項中X1X3、X3X4影響顯著（P<0.05），X1X2、X1X4、X2X3、X2X4均不顯著。

2.4.2 參數(shù)優(yōu)化。

在對類黑精提取率回歸模型的建立及檢驗對各因素回歸擬合后，得到回歸方程：

Y=66.373 33+0.592 5X1+0.541 667X2-0.005 833X3+0.798 333X4-0.964 583X21-0.307 5X1X2-0.48X1X3+0.43X1X4-1.035 833X22-0.187 5X2X3+0.015X2X4-0.864 583X23-0.475X3X4-0.613 333X24。

利用該回歸方程確定，編碼值為x1=0.633 587，x2=0.220 084，x3=-0.496 450，x4=1.067 846；此時響應值達到最大穩(wěn)定預測值67.048 34。將上述編碼值進行轉(zhuǎn)化，并結(jié)合情況確定酒糟類黑精最佳提取工藝：超聲時間23 min、超聲溫度55 ℃、pH 1.0、料液比1∶29（mg∶mL）。在此條件下進行驗證試驗，3次平行試驗類黑精提取率為（66.92±0.226）%，與預測值較為接近，說明回歸方程能夠比較真實地反映各因素對類黑精提取率的影響，得到的酒糟類黑精提取條件具有實際應用價值。

3 結(jié)論

該試驗通過未超聲和超聲輔助提取的類黑精提取率比較，結(jié)果顯示，超聲輔助提取能夠顯著提高酒糟類黑精提取率。在BB試驗選擇范圍內(nèi)，pH、超聲時間、超聲溫度和料液比為影響超聲輔助酒糟類黑精提取率的顯著因素，其影響由大到小分別是：料液比、超聲溫度、超聲時間及pH。超聲輔助酒糟類黑精最佳提取工藝：超聲時間23 min、超聲溫度55 ℃、pH 1.0、料液比1∶29（mg∶mL）、超聲功率540 W、顆粒直徑270 μm。

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