敵百蟲(chóng)在烏鱧體內(nèi)和水環(huán)境中的代謝動(dòng)力學(xué)及殘留研究

尹文林 姚嘉赟 盛鵬程 徐洋 潘曉藝 藺凌云 沈錦玉

摘要 [目的]明確敵百蟲(chóng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的安全性。[方法]全池潑灑0.5 mg/L敵百蟲(chóng)，采用氣相色譜法測(cè)定敵百蟲(chóng)在烏鱧體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)和殘留消除規(guī)律。[結(jié)果]烏鱧組織和水樣中敵百蟲(chóng)的最低檢測(cè)限為0.02 μg/mL。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，敵百蟲(chóng)在烏鱧血液中的濃度逐漸升高，120 h達(dá)最高，為0.072 mg/kg，至360 h時(shí)未檢出。肌肉中12 h內(nèi)未檢出，24 h濃度為0.023 mg/kg，120 h檢出最大濃度0.051 mg/kg，至288 h未檢出。肝臟8 h未檢出，12 h檢出濃度為0.026 mg/kg。使用敵百蟲(chóng)后，烏鱧體內(nèi)的藥物殘留量均低于我國(guó)的獸藥最高殘留限量要求，但在養(yǎng)殖水體中的殘留時(shí)間較長(zhǎng)，降解半衰期為35.19 h。[結(jié)論]為確保敵百蟲(chóng)使用后對(duì)水生態(tài)環(huán)境及食品安全，建議敵百蟲(chóng)使用后的休藥期為150 ℃·d。

關(guān)鍵詞 敵百蟲(chóng)；烏鱧；藥代動(dòng)力學(xué)；殘留；休藥期

中圖分類(lèi)號(hào) S482.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）06-0041-02

Study on Metabolism and Residue Dynamics of Trichlorfon in Channa argus

YIN Wen-lin， YAO Jia-yun， SHENG Peng-cheng， SHEN Jin-yu* et al

（Agriculture Ministry Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture，Key Laboratory of Fish Health and Nutrition of Zhejiang Province，Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries，Huzhou， Zhengjiang 313001）

Abstract [Objective] To study the safety of trichlorfon in aquaculture. [Method] The whole pool on 0.5 mg/L trichlorfon， the pharmacokinetics and residue elimination of trichlorfon in aquaculture water and Channa argus were determined by using the method of gas chromatography. [Result]

The minimum detection limit in tissue of and water samples was 0.02 ug/mL. With the extension of time， the blood concentration of trichlorfon in Channa argus increased gradually， the maximum concentration was 0.072 mg/kg at 120 h， and it was not detected at 360 h. The muscle tissue was not detected trichlorfon within 12 h， and the concentration of trichlorfon was 0.023 mg/kg at 24 h， the maximum concentration reached 0.051 mg/kg， and it was not detected at 288 h. The liver tissue was not detected trichlorfon within 8 h， and the concentration of trichlorfon was 0.026 mg/kg at 12 h. The drug residues of Channa argus were lower than the maximum residue limits of veterinary drugs in China， but the residual time in aquaculture water was longer， and the degradation half-life was 35.19 h.

[Conclusion]In order to ensure the use of trichlorfon water ecological environment and food safety， the study recommended withdrawal period was 150 ℃·d after using richlorfon.

Key words Trichlorfon；Channa argus；Pharmacokinetics；Residue elimination；Drug withdrawal period

敵百蟲(chóng)學(xué)名O，O-二甲基-（2，2，2-三氯-1-羥基乙基）膦酸酯，屬有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中運(yùn)用廣泛的殺蟲(chóng)劑之一。在淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中，敵百蟲(chóng)的藥效和安全性較好，常用于驅(qū)殺三代蟲(chóng)、指環(huán)蟲(chóng)、中華鳋、線(xiàn)蟲(chóng)等，在苗種生產(chǎn)過(guò)程中殺滅枝角類(lèi)、橈足類(lèi)等[1-2]。殺蟲(chóng)機(jī)理是水解后的產(chǎn)物能與蟲(chóng)體的膽堿酯酶相結(jié)合，使蟲(chóng)體神經(jīng)肌肉功能失常，先興奮，后麻痹，直至死亡[3-5]。90%晶體敵百蟲(chóng)在生產(chǎn)中的使用劑量為0.2～0.5 mg/L，苗種用量減半。敵百蟲(chóng)對(duì)魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)具有高效、低毒等特點(diǎn)，使用時(shí)主要采用全潑灑、浸浴等方法。長(zhǎng)期以來(lái)，有關(guān)敵百蟲(chóng)在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的吸收、代謝和殘留及其使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面的研究較少。我國(guó)獸藥標(biāo)準(zhǔn)和使用說(shuō)明，敵百蟲(chóng)的休藥期只能用500 ℃·d表示。為此，筆者研究敵百蟲(chóng)在養(yǎng)殖水體及烏鱧體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)和殘留情況，旨在為全面評(píng)估敵百蟲(chóng)的使用風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品試劑。

試驗(yàn)用的晶體敵百蟲(chóng)由江蘇南通江山農(nóng)藥化工廠生產(chǎn)，實(shí)測(cè)含量為（90.4±0.8）%。敵百蟲(chóng)的對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)獸藥檢驗(yàn)所，100 mg/瓶，編號(hào)為H0211104。

試驗(yàn)用丙酮和乙酸乙酯為色譜純，甲苯、無(wú)水乙酸鈉等試劑均為分析純，分析用水為去離子水（≥18 MΩ）。

1.1.2 材料魚(yú)。

試驗(yàn)魚(yú)購(gòu)自浙江省湖州市菱湖鎮(zhèn)，規(guī)格為（265.3±11.4） g/尾，在水池中暫養(yǎng)7 d后開(kāi)始試驗(yàn)，試驗(yàn)期間的水質(zhì)：pH 7.37，水溫（22±1） ℃，溶解氧>3.00 mg/L，氮氨含量0.05～0.15 mg/L，亞硝酸鹽氮含量0.05～0.24 mg/L，符合GB 1167《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》；放養(yǎng)密度為1.5 m深的水池中 5～7尾/m2，符合NY 5165《無(wú)公害食品 烏鱧養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范》中池塘單養(yǎng)的技術(shù)要求。

1.1.3 儀器與設(shè)備。

Aglient 6890N 氣相色譜儀，配FPD檢測(cè)器；渦旋振蕩器（國(guó)產(chǎn)）；氮吹儀（國(guó)產(chǎn)）；高速冷凍離心機(jī)（eppendorf 5424）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件。

VARIAV CP7821色譜檢測(cè)柱（30 m×0.25 mm）；升溫程序：35 ℃保持1 min，20 ℃/min升到150 ℃，保持2 min。進(jìn)樣口溫度180 ℃，載氣流速 1.0 mL/min，尾吹29 mL/min，H2流速4.3 mL/min，空氣流速175 mL/min，檢測(cè)器溫度300 ℃。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和最低檢測(cè)限。

取敵百蟲(chóng)對(duì)照品0.001 g，用甲苯溶解并定容至10 mL，配制成100 μg/mL的母液，依次用甲苯稀釋成0.04、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、15.00、20.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各標(biāo)準(zhǔn)溶液分別取1 μL進(jìn)行氣相測(cè)定。同時(shí)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做直線(xiàn)回歸分析，分別求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以檢測(cè)器產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)為噪聲值（S/N）3倍時(shí)的量為最低檢測(cè)限。

1.2.3 組織和水樣中敵百蟲(chóng)的提取和凈化。

將組織勻漿后，稱(chēng)取勻漿組織或血液0.50～2.00 g于25 mL具塞離心管中，加入乙酸乙酯10 mL，再加入1 g無(wú)水乙酸鈉，充分混勻3 min后，將上層乙酸乙酯吸入50 mL離心管中，殘?jiān)^續(xù)用乙酸乙酯10 mL提取1次，合并2次乙酸乙酯提取液，氮吹儀吹至約3 mL，待凈化。

敵百蟲(chóng)的凈化采用酸性氧化鋁固相萃取法，凈化前用5 mL甲醇和5 mL純化水活化，然后將提取液過(guò)固相萃取柱（1滴/s），再用5 mL乙酸乙酯淋洗（1滴/s），淋洗液在氮吹儀上吹干后，用1.0 mL甲苯溶出，0.22 μm濾膜過(guò)濾，取1 μL進(jìn)樣測(cè)定。

水樣直接用酸性氧化鋁柱固相萃取。固相萃取方法：酸性氧化鋁柱用5 mL甲醇和5 mL純化水活化后，取25 mL水樣過(guò)柱（1滴/s），然后用5 mL乙酸乙酯淋洗（1滴/s），淋洗收集于50 mL離心管中，在氮吹儀吹干后，用1.0 mL甲苯溶出，0.22 μm濾膜過(guò)濾，取1 μL進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.4 樣品回收率。

取10尾烏鱧，將血液、肌肉、肝臟分別混合后，均分為20組，同時(shí)取500 mL養(yǎng)殖池水，均分成20組；其中10組用于本底的測(cè)定，另10組分別加入敵百蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使組織中敵百蟲(chóng)濃度為0.5 mg/kg，按“1.2.3”提取凈化后，測(cè)定樣品回收率和日間變異系數(shù)。

1.2.5 給藥方法和樣品采集。

烏鱧暫養(yǎng)7 d后，稱(chēng)取適量的晶體敵百蟲(chóng)，用池水溶解后，0.5 mg/L全池潑灑，用藥后0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0 h及5、6、7、9、12、15、17、20 d分別采集5尾烏鱧和水樣50 mL。

樣品采集后，用紗布拭干，取血液、肌肉、肝等組織后，于-20 ℃保存，待測(cè)。水樣則當(dāng)天提取和凈化，次日測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

在該色譜條件下，敵百蟲(chóng)與雜質(zhì)分離較好，基線(xiàn)平穩(wěn)，峰形對(duì)稱(chēng)，出峰快，保留時(shí)間為5.49 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和最低檢測(cè)限

敵百蟲(chóng)在0.05～20.00 mg/L的濃度范圍內(nèi)，有良好的線(xiàn)性，回歸方程為y=12 544x+239.21，R2=0.999 4（圖1）。以檢測(cè)器產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)為噪聲值（S/N=3），最低檢測(cè)限為0.02 μg/mL。

2.3 本底和樣品回收率

測(cè)定的10尾烏鱧血液、肌肉、肝臟混合樣品中均未檢出敵百蟲(chóng)，這表明試驗(yàn)用烏鱧無(wú)敵百蟲(chóng)污染，可用于藥代動(dòng)力學(xué)和殘留測(cè)定。

由表1可知，在烏鱧組織樣品中平均回收率在80.60%～94.40%，日間變異系數(shù)為1.91%～4.47%。

2.4 敵百蟲(chóng)在烏鱧體內(nèi)的代謝和殘留

0.5 mg/L敵百蟲(chóng)全池潑灑后，烏鱧血液和組織中4 h內(nèi)均未檢出敵百蟲(chóng)。8 h后血液中敵百蟲(chóng)的檢出濃度為0.017 mg/kg，之后逐日增高，120 h達(dá)到0.072 mg/kg（最高濃度），144 h開(kāi)始逐日降低，至360 h未檢出。肌肉中12 h內(nèi)未檢出敵百蟲(chóng)，24 h時(shí)檢測(cè)0.023 mg/kg，120 h檢出最大濃度0.051 mg/kg，144 h濃度開(kāi)始下降，至288 h未檢出敵百蟲(chóng)。而肝臟的情況較為復(fù)雜，8 h未檢出敵百蟲(chóng)，12 h檢出濃度為0.026 mg/kg，在48～168 h濃度在0.033～0.058 mg/kg，216 h肝組織中敵百蟲(chóng)迅速減少，至360 h未檢出（圖2）。

2.5 敵百蟲(chóng)在養(yǎng)殖水體中的降解

在pH為7.37，水溫（22±1） ℃環(huán)境條件下，用90%晶體敵百蟲(chóng)全池潑灑后（敵百蟲(chóng)的濃度為0.45 mg/L）潑灑后，敵百蟲(chóng)在養(yǎng)殖水體中緩慢降解，降解公式為y=0.459 7e-0.020 3t，R2=0.990 4，降解半衰期為35.19 h（圖3）。

3 討論與結(jié)論

（1）在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中，敵百蟲(chóng)是最常用的漁用殺蟲(chóng)劑之一，具有使用時(shí)間長(zhǎng)、使用效果穩(wěn)定、對(duì)魚(yú)類(lèi)安全等特點(diǎn)，但由于我國(guó)漁用藥物的研究主要集中在藥效學(xué)和毒理學(xué)等方面，因此對(duì)敵百蟲(chóng)等常用漁用藥物缺乏系統(tǒng)的使用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。而敵百蟲(chóng)作為一種有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，可顯著抑制乙酰膽堿酯酶活性[6]、誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化損傷[7]、降低機(jī)體免疫力[8]等毒副作用，在水產(chǎn)動(dòng)物、養(yǎng)殖水體和水域生態(tài)環(huán)境中的蓄積、遷移和殘留有一定潛在風(fēng)險(xiǎn)，如對(duì)羅氏沼蝦仔蝦的96 h LC50僅為0.017 mg/L，對(duì)羅氏沼蝦幼蝦的96 h LC50為0.047 mg/L，因此敵百蟲(chóng)在水產(chǎn)動(dòng)物、養(yǎng)殖水體和水域生態(tài)環(huán)境中的蓄積、遷移和殘留存在著一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)[7，9]。同時(shí)在使用上有一定的盲目性，如敵百蟲(chóng)在國(guó)標(biāo)使用說(shuō)明上標(biāo)注的休藥期為500 ℃·d。為此，對(duì)常用漁用藥物的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，降低水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的殘留，提高水產(chǎn)品的品質(zhì)具有重要意義，更重要的是要防止?jié)O用藥物對(duì)水域生態(tài)環(huán)境造成壓力，在保護(hù)生態(tài)環(huán)境的前提下，合理高效地使用漁用藥物。

（2）在敵百蟲(chóng)檢測(cè)方面，基本采用“水產(chǎn)品中敵百蟲(chóng)殘留量的測(cè)定——?dú)庀嗌V法”等相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)。但在樣品前處理上，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用乙腈水溶液提取后，用大劑量的三氯甲烷萃取凈化，該方法使用的有機(jī)溶劑量較大，樣品處理時(shí)間較長(zhǎng)，而用固相萃取法，則可以對(duì)樣品進(jìn)行批量處理，樣品的溶縮和凈化速度快，適用于大批量的樣品處理。這2種方法的色譜條件、精密度、檢出限等均無(wú)明顯差異。因此，建議在大批量樣品處理較多時(shí)，采用固相萃取法，以節(jié)約樣品處理時(shí)間。

（3）該研究表明，敵百蟲(chóng)0.50 mg/L全池潑灑，烏鱧體內(nèi)的藥物殘留量符合我國(guó)食品獸藥最高殘留限量，但在養(yǎng)殖水體中的殘留時(shí)間較長(zhǎng)，降解半衰期為35.19 h，為確保敵百蟲(chóng)使用后的水生態(tài)環(huán)境及食品安全，建議敵百蟲(chóng)使用后的休藥期為150 ℃·d。

參考文獻(xiàn)

[1] 張學(xué)祖.飛速發(fā)展中的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑“敵百蟲(chóng)”[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，1959（2）：70-72.

[2] 張為農(nóng).敵百蟲(chóng)供求趨勢(shì)繼續(xù)看好：2007年農(nóng)業(yè)需求量有望突破萬(wàn)噸[J].農(nóng)化新世紀(jì)，2005（12）：23.

[3] 高希武，郭艷春.新編實(shí)用農(nóng)藥手冊(cè)[M].鄭州：中原農(nóng)業(yè)出版社，2002：116-119.

[4] CRISP T M，CLEGG E D，COOPER R L，et al.Environmental endocrine disruption：An effects assessment and analysis[J].Environmental health perspectives，1998，106（S1）：11-56.

[5] Office of Research and Development Washington，DC.Fact sheet，EPA special report on endocrine disruption[R].1997.

[6] 楊先樂(lè)，湛嘉，黃艷平.有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)水生生物毒性影響的研究進(jìn)展[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，11（4）：378-382.

[7] CHANG C C，LEE P P，LIU C H，et al.Trichlorfon，an organophosphorus insecticide，depresses the immune responses and resistance to Lactococcus garvieae of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii[J].Fish & shelllish immunology，2006，20（4）：574-585.

[8] FENG T，LI Z B，GUO X Q，et al.Effects of trichlorfon and sodium dodecyl sulphate on antioxidant defense system and acetylcholinesterase of Tilapia nilotica in vitro[J].Pesticide biochemistry and physiology，2008，92（3）：107-113.

[9] TIAN S Z， LIU Z， WENG J H，et al. Growth of Chlorella vulgaris in cultures with low concentration dimethoate as source of phosphorus[J].Chemosphere，1997，35（11）：2713-2718.