基于高通量測序的鄱陽湖典型濕地土壤細菌群落特征分析

王 鵬,陳 波,張 華

1 江西師范大學鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室, 南昌 330022 2 江西師范大學地理與環境學院, 南昌 330022

基于高通量測序的鄱陽湖典型濕地土壤細菌群落特征分析

王 鵬1,2,*,陳 波1,2,張 華1,2

1 江西師范大學鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室, 南昌 330022 2 江西師范大學地理與環境學院, 南昌 330022

采用高通量測序技術分析了鄱陽湖典型濕地土壤細菌群落特征。測序結果表明,不同植被土壤細菌群落豐度與多樣性的排序相同：苔草帶>苔草-虉草帶>蘆葦帶>泥灘帶>藜蒿帶。沿湖面至坡地,空間位置相近的土壤細菌群落結構具有更大的相似性,苔草-虉草帶、苔草帶和蘆葦帶的細菌群落結構相近,泥灘帶和藜蒿帶的細菌群落結構差異較大。變形菌門(30.0%)是濕地土壤平均相對豐度最高的門,其次為酸桿菌門(16.7%)和綠彎菌門(16.5%)；多數門分類細菌相對豐度沿湖面至坡地存在一定變化趨勢。硝化螺菌屬是第一大屬分類水平細菌群落。在土壤化學指標中,與鄱陽湖濕地細菌群落相關性較大的是總磷、銨態氮和有機質含量。以上研究結果表明,鄱陽湖濕地不同植被土壤細菌群落具有結構性差異,但沿湖面至坡地存在規律性變化。

鄱陽湖濕地；高通量測序；細菌多樣性；細菌群落結構

濕地作為陸地與水生生態系統的過渡區域,獨特的水土界面環境和較高的生物生產力促進了碳、氮、磷等元素的快速循環轉化,是陸地地表元素遷移和轉化的重要場所。微生物是濕地生態系統的分解者,在濕地物質能量循環中起著重要作用[1]。查明濕地微生物群落結構及分布特征,有助于分析微生物與環境因子的關系,闡明濕地元素遷移轉化的機理,為制定合理的濕地管理策略提供科學依據。隨著分子生物學的發展,尤其是低成本、自動化的高通量測序技術[2]的應用,能同時對樣品中的優勢物種、稀有物種及一些未知的物種進行檢測,獲得樣品中的微生物群落組成,在水體[2- 5]、沉積物[6- 7]和土壤[8- 10]微生物群落結構研究中得到廣泛應用。

鄱陽湖是我國第一大淡水湖,也是生態多樣性豐富的淡水濕地系統。鄱陽湖濕地是我國重要的生態功能保護區,是世界自然基金會劃定的全球重要生態區,承擔著調洪蓄水、調節氣候、降解污染等多種生態功能,也是白鶴、東方白鸛和小天鵝等數百種珍稀水鳥的越冬地[11]。由于鄱陽湖湖盆的獨特自然地理特征,鄱陽湖濕地生態環境受水位變化影響大,濕地植物群落沿水分梯度分布,呈現條帶狀的總體格局[12- 13]。鄱陽湖濕地不同植被土壤微生物群落結構有何特征？這種群落結構特征與碳、氮、磷等土壤化學指標有何關系？闡明這些問題對深入理解鄱陽湖濕地生態系統的物質和能量循環具有重要意義。目前鄱陽湖濕地微生物群落的研究較少,主要包括不同濕地植物土壤微生物量[14]、土壤微生物群落對碳源的利用[15]、湖泊沉積物及水體的微生物群落結構[7,16- 17]等方面的研究,尚缺少對鄱陽湖不同濕地植物土壤微生物群落結構及其與環境因子關系的研究。

本次研究選擇鄱陽湖典型自然濕地,基于高通量測序分析不同濕地植被土壤的細菌群落特征,探討細菌群落與土壤化學指標的關系,為鄱陽湖生態管理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本次研究選擇贛江主支河口附近的鄱陽湖典型濕地進行,該典型濕地(圖 1)地形由陸地向湖區逐漸傾斜,走向與湖水退水方向一致。最高處毗鄰贛江河堤,高程約為18.4 m。近湖區地勢相對平坦,與鄱陽湖大湖面相接,高程約為11.2 m。濕地受水位季節性變化影響顯著,枯水期水位下降,沿湖面至坡地分布泥灘帶、苔草-虉草帶、苔草帶、蘆葦帶和藜蒿帶；豐水期水位上漲,除藜蒿帶和部分蘆葦帶外大部分洲灘被淹沒。洲灘土壤粒徑由湖面至坡地逐漸變大,砂性土壤比例增大。

圖1 研究區位置及采樣點示意圖 Fig.1 Sketch map of study area and sampling sites

1.2 土樣采集與理化分析

枯水期2014年11月2日分別在泥灘帶、苔草-虉草帶、苔草帶、蘆葦帶和藜蒿帶采集土壤樣品。每處土樣采用S型5點取樣法,取樣深度為0—10 cm。采集的每處5個土樣分為兩部分,一部分用于化學指標測試,另一部分充分混合用于DNA提取和高通量測序。

1.3 細菌16S rRNA 基因測序

采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)提取土壤總DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。對16S rRNA基因的V3-V4高變區片段進行PCR擴增,引物序列[18]為338F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA- 3′)和 806R(5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)。擴增條件為：95 °C預變性2 min,接著進行25個循環,包括95°C變性30 s,55°C退火30 s,72°C延伸30 s；循環結束后72°C最終延伸5 min。每個樣本3個重復,將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物,Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結果,將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量,按照每個樣本的測序量要求,進行相應比例的混合。測序在上海美吉生物醫藥科技有限公司的Illumina Miseq PE300平臺進行。

1.4 生物信息處理

利用Mothur(V.1.36.1)對原始DNA序列進行過濾處理,去除嵌合體,得到優化序列；按照97%相似性將優化序列劃分可操作分類單元(OTU,Operational Taxonomic Units)；基于OTU進行稀釋性曲線分析,并計算Chao1豐度指數、覆蓋度(Coverage)和Shannon多樣性指數。利用主成分分析(PCA)分析各樣間OTU相似性。對比Silva(Release119, http://www.arb-silva.de)16S rRNA數據庫,采用RDP Classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析,并在各個分類水平上統計每個樣品的群落組成；利用冗余分析研究土壤化學指標與細菌群落的關系。

2 結果

2.1 細菌群落豐度、多樣性和結構差異

5個土壤樣品的高通量測序共得到134 223條高質量序列,平均長度為438.50 bp。以97%相似度劃分,共得到2 072個OTUs。表 1為5個土壤樣品中的優化序列、OTU數量及多樣性指數。各樣品文庫的覆蓋率(Coverage)范圍為99.04%—99.65%,說明土樣中基因序列被檢出的概率很高,本次測序結果能夠代表濕地土壤細菌群落的真實情況。

表 1為反映鄱陽湖濕地土壤細菌豐度和多樣性的相關指數。Chao1指數用于估算樣品中所含OTU總數,反映了菌群豐度,Chao1越大說明細菌群落豐度越高。Shannon指數反映細菌群落alpha多樣性指數,Shannon值越大,說明細菌群落多樣性越高。由表1可知,5種植被土壤細菌群落豐度與多樣性的排序是一致的：苔草帶(S3)>苔草-虉草帶(S2)>蘆葦帶(S4)>泥灘帶(S1)>藜蒿帶(S5)。

圖2 采樣點土壤OTU的主成分分析 Fig.2 Principal component analysis of OTU in sampling soils

對5種土壤中OTU的組成進行PCA分析(圖 2),第一主軸和第二主軸的貢獻率分別為45.4%和31.2%。苔草帶(S3)和蘆葦帶(S4)之間的距離最近,表明兩者土壤OTU組成相近；苔草-虉草帶(S2)和泥灘帶(S1),以及苔草-虉草帶(S2)和苔草帶(S3)的土壤OTU組成也相近,但差異性大于苔草帶(S3)和蘆葦帶(S4)；藜蒿帶(S5)和其它4種植被土壤OTU組成的差異都較大,其中與蘆葦帶(S4)的差異相對較小。沿湖面至坡地,空間位置相近的土壤細菌群落結構也相近；苔草-虉草帶(S2)、苔草帶(S3)和蘆葦帶(S4)的細菌群落結構相對相近,泥灘帶(S1)和藜蒿帶(S5)的細菌群落結構差異較大。

2.2 細菌門水平分類和屬水平分類

5個鄱陽湖濕地土壤樣品的2 072條OTUs分屬于37個門,86個綱,176個目,294個科,401個屬,718個種。圖 3為門水平上的細菌分類。相對豐度較高的分別為變形菌門(Proteobacteria,30.0%),酸桿菌門(Acidobacteria,16.7%),綠彎菌門(Chloroflexi,16.5%),硝化螺旋菌門(Nitrospirae,10.2%),厚壁菌門(Firmicutes,7.5%),放線菌門(Actinobacteria,4.8%),芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,3.8%)和綠菌門(Chlorobi,1.8%)。變形菌門(Proteobacteria)是鄱陽湖濕地土壤的優勢類群,主要包括α-變形菌綱(Alphaproteobacteria,7.2%)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria,8.9%)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria,10.5%)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria,2.8%)；ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)平均豐度僅為0.1%。

苔草-虉草帶(S2)、苔草帶(S3)和蘆葦帶(S4)土壤具有相近的細菌群落結構(圖 2),相對豐度最高的都是變形菌門(Proteobacteria),分別為31.9%,45.8%和35.5%。除變形菌門(Proteobacteria)外,苔草-虉草帶(S2)相對豐度較高的分別為綠彎菌門(Chloroflexi,16.1%)和厚壁菌門(Firmicutes,15.3%)；苔草帶(S3)相對豐度較高的分別為硝化螺旋菌門(Nitrospirae,13.5%)和酸桿菌門(Acidobacteria,8.5%)；蘆葦帶(S4)相對豐度較高的分別為酸桿菌門(Acidobacteria,18.8%)和綠彎菌門(Chloroflexi,11.6%)。與其它3種植被土壤相比,泥灘帶(S1)和藜蒿帶(S5)細菌群落結構差異較大(圖 2)；泥灘帶(S1)相對豐度最高的是綠彎菌門(Chloroflexi,24.9%),其次為硝化螺旋菌門(Nitrospirae,20.2%)和變形菌門(Proteobacteria,17.6%)；藜蒿帶(S5)相對豐度最高的是酸桿菌門(Acidobacteria,32.0%),其次為綠彎菌門(Chloroflexi,22.4%)和變形菌門(Proteobacteria,19.1%)。

圖3 鄱陽湖濕地土壤細菌門水平分類 Fig.3 Relative abundances of bacterial phyla in Poyang Lake wetland soils

沿湖面至坡地,5種植被土壤的門分類細菌相對豐度存在一定變化趨勢(圖 3)。變形菌門(Proteobacteria)相對豐度存在先增大,后減小的趨勢,在苔草帶(S3)達到最大；酸桿菌門(Acidobacteria)沿湖面至坡地相對豐度大致呈不斷增大的趨勢；綠彎菌門(Chloroflexi)沿湖面至坡地,存在先減小后增大的趨勢,在苔草帶(S3)達到最小；硝化螺旋菌門(Nitrospirae)不存在明顯變化趨勢,在泥灘帶(S1)和苔草帶(S3)相對豐度較高,在藜蒿帶(S5)則很小。厚壁菌門(Firmicutes)在苔草-虉草帶(S2)達到最大,沿湖面至坡地大致呈不斷減小的趨勢；放線菌門(Actinobacteria)沿湖面至坡地大致呈增大趨勢；芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)沿湖面至坡地呈先增大后減小趨勢；綠菌門(Chlorobi)沿湖面至坡地沒有明顯變化趨勢。

圖 4為屬分類水平上的細菌分類,將平均豐度低于1.5%的部分合并為others在圖中顯示,剩余16個屬水平分類中有5個屬于分類學數據庫分類學譜系的中間等級,沒有科學名稱,以norank作為標記；6種細菌屬于未培養細菌,以uncultured表示。屬水平分類細菌包括大量未分類和未培養細菌,給研究細菌的生態功能帶來困難。硝化螺菌屬(Nitrospira)是豐度最高的屬,平均豐度為10.2%,也是硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的唯一屬水平分類,是泥灘帶(S1)、苔草帶(S3)和蘆葦帶(S4)相對豐度最大的屬,也是苔草-虉草帶(S2)相對豐度第2大的屬,但在藜蒿帶(S5)相對豐度很小(0.4%)。厭氧繩菌科的一部分屬水平未培養細菌(Anaerolineaceae_uncultured)平均豐度為5.3%,占綠彎菌門(Chloroflexi)的33.2%,在泥灘帶(S1)的相對豐度最高(13.4%)。酸桿菌科中的一部分屬水平未培養細菌(Acidobacteriaceae_(Subgroup_1) _uncultured)平均豐度為5.0%,占酸桿菌門(Acidobacteria)的55.4%,沿湖面至坡地呈增大趨勢,是藜蒿帶(S5)相對豐度最大的屬。乳球菌屬(Lactococcus)平均豐度為4.6%,在厚壁菌門(Firmicutes)中占52.5%,是苔草-虉草帶(S2)相對豐度最大的屬。亞硝化單胞菌科的一部分屬水平未培養細菌(Nitrosomonadaceae_uncultured)平均豐度為3.8%,占變形菌門(Proteobacteria)的13.0%,主要分布在苔草-虉草帶(S2)、苔草帶(S3)和蘆葦帶(S4)。

圖4 鄱陽湖濕地土壤細菌屬水平分類Fig.4 Relative abundances of bacterial genera in Poyang Lake wetland soils

2.3 細菌群落與土壤化學指標的關系

表2 采樣點土壤化學指標

圖5 鄱陽湖濕地土壤細菌門分類群落與土壤化學指標的冗余分析 Fig.5 Redundancy analysis of bacterial phyla and chemical parameters in Poyang Lake wetland soils

3 討論

物種多樣性是維持生態系統正常功能的前提條件[19],細菌群落的豐富性和多樣性使濕地在營養鹽循環、有機物降解、重金屬形態轉化和溫室氣體排放等方面起著重要的生態功能[20- 22]。本次研究區的5種濕地植物土壤類型中,土壤細菌群落豐度和多樣性的大小具有一致：苔草帶>苔草-虉草帶>蘆葦帶>泥灘帶>藜蒿帶(表 1),即沿湖面至坡地的土壤斷面中,中間位置的土壤具有更高的菌群豐度和多樣性；同時空間位置相近的土壤細菌群落結構具有更大的相似性(圖 2)。由于鄱陽湖水位的季節性變化,5種土壤的淹水時間和淹水頻率有較大差別,采樣點所處的藜蒿帶除在特大洪水年份一般不會被淹水,泥灘帶一年大部分時間都處于淹水狀態,其它3種土壤則隨鄱陽湖水位漲落處于季節性干濕交替狀態。很多研究表明水文條件的變化對土壤微生物群落有重要影響[23- 24],Foulquier等[25]研究認為干濕交替的環境有利于一部分細菌的生長,永久淹沒區和干濕交替區土壤的微生物群落存在結構性差異。Yu等[26]對沿水文梯度分布的不同濕地研究發現,平均水位和水位變化都會影響土壤微生物群落,但由水文變化引起的沉積作用導致的土壤基質差異對濕地微生物群落的影響更大。鄱陽湖濕地的季節性水位變化及其引起的土壤基質差異可能對土壤細菌群落結構有著重要影響。除水文條件外,不同植被的根系特征,如附著面、根系分泌物和限際氧化還原條件也可能對土壤細菌群落造成影響[27- 28]。

酸桿菌門是藜蒿帶相對豐度最高的門,也是研究區土壤平均相對豐度第2高的門；酸桿菌門大多為未培養細菌,目前研究較少,但廣泛存在于土壤中,16S rRNA基因克隆文庫的分析表明酸桿菌門在典型土壤的豐度約為20%[38],與本文5種土壤的平均豐度(16.7%)接近；Zeglin等[39]分析了河流沖積物沿水分梯度的細菌群落變化,發現酸桿菌門在干旱土壤的豐度較高,這與本次研究結果類似,酸桿菌門相對豐度沿湖面至坡地相對豐度大致呈不斷增大的趨勢,在很少被淹沒的藜蒿帶達到最大。綠彎菌門是泥灘帶土壤相對豐度最高的門,也是研究區平均相對豐度第3高的門。綠彎菌門與SOC呈負相關性(圖 5),綠彎菌門是一類通過光合作用,以CO2為碳源產生能量的細菌[40]；綠彎菌門的這種光合特性可能使其在SOC含量較低的土壤中具有競爭優勢。另外有研究表明綠彎菌門在水位頻繁變化的潮間帶土壤含量較高[36,41],泥灘帶較高的綠彎菌門豐度可能也與其頻繁的水位變化有關。硝化螺旋菌是研究區土壤平均相對豐度第4高的門,只包含了硝化螺菌屬一個屬,硝化螺菌屬也是濕地土壤平均豐度最高的屬分類單元；一般濕地土壤的硝化螺旋菌門豐度很小(<1%)[36],遠低于本次研究結果(13.5%),同時亞硝化單胞菌科的一部分屬水平未培養細菌也是變形菌門豐度最大的屬分類群落(圖 4)；這些都表明氮素循環在鄱陽湖濕地生態功能中可能占有重要地位。

4 結論

(1)高通量測序結果表明鄱陽湖濕地5個土壤樣品中的2 072個OTUs分屬于37個門,86個綱,176個目,294個科,401個屬,718個種,樣品中包括大量未分類和未培養細菌。植被土壤細菌群落豐度與多樣性的排序是一致的：苔草帶>苔草-虉草帶>蘆葦帶>泥灘帶>藜蒿帶。

(2)變形菌門(Proteobacteria,30.0%)是鄱陽湖濕地平均相對豐度最高的門,其次為酸桿菌門(Acidobacteria,16.7%),綠彎菌門(Chloroflexi,16.5%),硝化螺旋菌門(Nitrospirae,10.2%),厚壁菌門(Firmicutes,7.5%)。硝化螺菌屬(Nitrospira)是第一大屬分類水平細菌群落。

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High throughput sequencing analysis of bacterial communities in soils of a typical Poyang Lake wetland

WANG Peng1,2,*, CHEN Bo1,2,ZHANG Hua1,2

1KeyLaboratoryofPoyangLakeWetlandandWatershedResearch,MinistryofEducation,JiangxiNormalUniversity,Nanchang330022,China2SchoolofGeographyandEnvironment,JiangxiNormalUniversity,Nanchang330022,China

Poyang Lake wetland; high throughput sequencing; bacterial diversity; bacterial community structure

江西省自然科學基金(20151BAB213035)；鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室(江西師范大學)主任開放基金(ZK2013009)；江西省教育廳科技計劃項目(GJJ14267)；江西省重大生態安全問題監控協同創新中心資助項目(JXS-EW-00)

2015- 10- 05;

日期:2016- 07- 13

10.5846/stxb201510052000

*通訊作者Corresponding author.E-mail: wangpengjlu@outlook.com

王鵬,陳波,張華.基于高通量測序的鄱陽湖典型濕地土壤細菌群落特征分析.生態學報,2017,37(5):1650- 1658.

Wang P, Chen B,Zhang H.High throughput sequencing analysis of bacterial communities in soils of a typical Poyang Lake wetland.Acta Ecologica Sinica,2017,37(5):1650- 1658.