高產(chǎn)洛伐他汀的功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液最佳pH值的研究

齊文武，陳曉云，鄭世茂，龐 欣

(北京東方紅航天生物技術(shù)股份有限公司，北京 101400)

高產(chǎn)洛伐他汀的功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液最佳pH值的研究

齊文武，陳曉云，鄭世茂，龐 欣

(北京東方紅航天生物技術(shù)股份有限公司，北京 101400)

目的：研究功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液的pH對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響。方法：基于現(xiàn)有的發(fā)酵工藝，設(shè)置了4個(gè)營(yíng)養(yǎng)液pH梯度，分別為3.4、3.6、3.8和4.0，希望找到高產(chǎn)洛伐他汀的最佳pH條件。結(jié)果：當(dāng)pH=3.6時(shí)，洛伐他汀含量相對(duì)較高，但是色價(jià)較低；當(dāng)pH=3.4時(shí)，洛伐他汀的含量相對(duì)較低，但是色價(jià)較高，但仍然達(dá)不到功能性紅曲米的要求，需在下一步的工作中繼續(xù)改進(jìn)。所有的處理?xiàng)l件下，均未檢出桔青霉素。結(jié)論：功能性紅曲固態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)洛伐他汀的營(yíng)養(yǎng)液最佳pH值為3.6。

功能性紅曲；洛伐他汀；固態(tài)發(fā)酵；最佳pH；營(yíng)養(yǎng)液

紅曲霉的固體發(fā)酵產(chǎn)物紅曲也稱為紅曲米，最早發(fā)明在漢代，在我國(guó)已有上千年的歷史，可做藥用和食用[1-2]。其中以明代李時(shí)珍所著《本草綱目》對(duì)紅曲的記載最為完整，其性味甘、溫，無(wú)毒，歸肝、脾、胃、大腸經(jīng)。紅曲有健胃消食、活血化瘀等功效[3]。

1979年，日本科學(xué)家Endo等[3]從紅色紅曲霉的培養(yǎng)液中分離出活性物質(zhì)紅曲可林k，此發(fā)現(xiàn)引起多國(guó)專家學(xué)者對(duì)紅曲霉進(jìn)行了深入研究，取得了令人矚目的成果。隨著研究的深入，紅曲霉中越來(lái)越多具有藥用價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)[4-5]。

發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的pH值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)，是一項(xiàng)重要的發(fā)酵參數(shù)，它對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的累積有很大的影響。在紅曲發(fā)酵過程中，由于營(yíng)養(yǎng)液的pH值會(huì)影響洛伐他汀的代謝過程，使洛伐他汀的產(chǎn)生量和產(chǎn)生比例發(fā)生改變，因此營(yíng)養(yǎng)液的最適pH值一直受到研究人員的廣泛重視。由于工業(yè)化生產(chǎn)管理相對(duì)比較寬泛，綜合各項(xiàng)管理成本，營(yíng)養(yǎng)液pH值一般設(shè)定為一個(gè)范圍，而非一個(gè)精確的數(shù)值。隨著pH檢測(cè)設(shè)備由實(shí)驗(yàn)室逐步走進(jìn)企業(yè)，使?fàn)I養(yǎng)液pH的精確控制成為可能。

本研究針對(duì)紅曲霉固態(tài)發(fā)酵過程中營(yíng)養(yǎng)液pH 對(duì)洛伐他汀、桔青霉素含量和紅曲色素的影響，探究在低或無(wú)桔青霉素基礎(chǔ)上紅曲霉固態(tài)發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液的最佳pH培養(yǎng)條件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 實(shí)驗(yàn)所用菌種為本公司制備保存的菌種，菌種編號(hào)：HT331511191111。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基材料 色譜級(jí)甲醇、無(wú)水乙醇、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、葡萄糖、酵母浸膏和大米粉等。

1.1.3 儀器設(shè)備 Waters高效液相色譜儀、雙光束紫外分光光度計(jì)、分析天平、醫(yī)用離心機(jī)、高速粉碎機(jī)、超聲波清洗機(jī)、水浴鍋、各種型號(hào)標(biāo)準(zhǔn)篩等。

1.2 發(fā)酵方法

1.2.1 接種 將保藏菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)72 h后接種于固體培養(yǎng)基。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 液體培養(yǎng)基的物料按比例準(zhǔn)確稱量，混勻，250mL/瓶進(jìn)行分裝，121℃，滅菌20 min，備用；固體營(yíng)養(yǎng)液的物料按比例準(zhǔn)確稱量，混勻，試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH分別為3.4、3.6、3.8、4.0備用，做好標(biāo)記；將配好的營(yíng)養(yǎng)液加入按一定比例配好的大米粉混料中，充分混勻，進(jìn)行分裝，121℃、滅菌30 min，備用。

1.2.3 發(fā)酵、烘干、粉碎 經(jīng)過高溫發(fā)酵、低溫發(fā)酵得到紅曲。紅曲經(jīng)過烘干、粉碎、過篩、混勻、取樣檢測(cè)。

1.3 洛伐他汀含量測(cè)定方法(參照本公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn))

1.3.1 色譜參考條件 色譜柱C185 μm×150 mm×4.6 mm；波長(zhǎng)237 nm；柱溫25℃；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相，甲醇∶水∶磷酸=850∶150∶0.4(體積分?jǐn)?shù))。

1.3.2 處理方法 樣品全部經(jīng)過100目標(biāo)準(zhǔn)篩，稱取樣品0.1～0.2 g，至8 mL的離心管，精密加入4 mL的75%乙醇超聲處理60 min(溫度50～70℃，15～20 min搖勻1次)，取出，3 000～4 000 r/min離心10 min，吸取上清液1 mL，置于8 mL刻度試管，加入0.5 mL的0.1mol/L 氫氧化鈉-乙醇溶液，搖勻，靜置10 min，加入0.5 mL的0.1mol/L 磷酸-乙醇溶液，搖勻，靜置10 min，離心，取上清液 5μL，檢測(cè)。

稱取標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，至50 mL的容量瓶，定容，混勻。吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)液，置于8 mL刻度試管，加入0.5 mL的0.1mol/L 氫氧化鈉-乙醇溶液，搖勻，靜置10 min，加入0.5mL的0.1mol/L 磷酸-乙醇溶液，搖勻，靜置10 min，離心，取上清液5 μL，檢測(cè)。

1.3.3 計(jì)算公式 樣品含量計(jì)算公式如式(1)：

(1)

1.4 紅曲粉中紅色素含量測(cè)定

1.4.1 測(cè)定條件 紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)505 nm、10 mm比色皿。

1.4.2 測(cè)定方法 參照《GB 1886.19-2015》[6]，樣品全部過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，準(zhǔn)確稱取紅曲粉0.2 g，置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，60±0.5℃水浴中，準(zhǔn)確浸泡1 h，冷卻并定容，搖勻，過濾，備用，以色價(jià)高低表示紅色素含量高低。以70%乙醇作為參比溶液，于紫外分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度A值。

1.4.3 計(jì)算公式

(2)

式(2)中：X——紅曲粉樣品的色價(jià)(u/g)；A——樣品浸泡液的吸光度；m——取樣紅曲粉的質(zhì)量(g)。

1.5 桔青霉素的測(cè)定

桔青霉素的測(cè)定依據(jù)《GB/T5009.222-2008》[7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)采用方差分析方法，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH對(duì)紅曲發(fā)酵產(chǎn)物的影響

由圖1—4的圖譜的峰形基本一致，表明同一菌種發(fā)酵得到的紅曲粉，盡管固體營(yíng)養(yǎng)液的pH值不同，但發(fā)酵產(chǎn)物除洛伐他汀含量不同外，其他成分基本一致，說明營(yíng)養(yǎng)液pH在 3.4～4.0的范圍內(nèi)，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的組分沒有顯著影響，但洛伐他汀的產(chǎn)生量有所不同。

圖1 pH=3.4時(shí)洛伐他汀含量圖譜

圖2 pH=3.6時(shí)洛伐他汀含量圖譜

圖3 pH=3.8時(shí)洛伐他汀含量圖譜

圖4 pH=4.0時(shí)洛伐他汀含量圖譜

2.2 營(yíng)養(yǎng)液pH對(duì)洛伐他汀含量的影響

為了保證數(shù)據(jù)的可靠性，完全相同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共進(jìn)行了2次，每次4個(gè)處理、3個(gè)重復(fù)。將2次結(jié)果取均值，采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，不同pH值的營(yíng)養(yǎng)液對(duì)洛伐他汀的含量有顯著性差異。 pH 3.6的營(yíng)養(yǎng)液處理后的樣品中洛伐他汀含量顯著高于3.4、3.8和4.0等3個(gè)不同pH值處理的樣品(P<0.05)，其中以pH 3.6處理后的樣品中洛伐他汀的含量最高，pH 3.4處理后的樣品中洛伐他汀含量最低。

圖5 不同pH對(duì)紅曲產(chǎn)洛伐他汀的影響

2.3 營(yíng)養(yǎng)液pH對(duì)色價(jià)的影響

圖6表明，該工藝條件下，pH在3.6～4.0區(qū)間，色價(jià)處于一個(gè)較低的水平，而且色價(jià)的合成曲線與洛伐他汀含量曲線呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。這與他人研究的洛伐他汀的產(chǎn)生會(huì)抑制紅曲色素的生成結(jié)果相一致[8]。

圖6 色價(jià)檢測(cè)曲線

2.4 營(yíng)養(yǎng)液pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物桔青霉素含量的影響

從附表可以看出，pH在3.4～4.0的范圍內(nèi)桔霉素均未檢出，為今后工藝改進(jìn)創(chuàng)造了良好的前提條件。

附表 不同pH對(duì)紅曲產(chǎn)桔青霉素的影響

3 討論

紅曲具有輔助降血脂的功能，是目前國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的原料之一，紅曲作為重要的保健食品原料已開發(fā)出多種產(chǎn)品。紅曲的固體發(fā)酵在我國(guó)已有上千年的歷史，發(fā)酵菌種繁多，發(fā)酵工藝各異。同一菌種，不同發(fā)酵工藝對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物有何影響均需仔細(xì)研究。一方面提高目的產(chǎn)物的含量可以有效節(jié)約成本，另一方面改變發(fā)酵工藝是否會(huì)改變其他代謝產(chǎn)物的產(chǎn)出，甚至是否會(huì)產(chǎn)生有害的桔青霉素，是更加值得我們重視的問題。

工業(yè)上主要采用紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的方式生產(chǎn)洛伐他汀，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)洛伐他汀的產(chǎn)量影響很大，當(dāng)培養(yǎng)條件不適時(shí)，洛伐他汀的產(chǎn)量極微，甚至不產(chǎn)生[9-10]。因此，要想提高洛伐他汀的產(chǎn)量，需從優(yōu)化培養(yǎng)條件入手。大工業(yè)生產(chǎn)中，考慮到人工、生產(chǎn)成本等因素通常采用pH試紙測(cè)定營(yíng)養(yǎng)液的pH，固體營(yíng)養(yǎng)液的pH一般控制在3.4～4.0之間，范圍較寬。不同的pH值會(huì)導(dǎo)致每批洛伐他汀的產(chǎn)量不同，因此，在工業(yè)生產(chǎn)中進(jìn)一步精確控制營(yíng)養(yǎng)液的pH，對(duì)提高洛伐他汀的生產(chǎn)水平，降低成本生產(chǎn)意義重大。隨著pH測(cè)試筆在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，使精確控制營(yíng)養(yǎng)液pH 值成為可能。本研究對(duì)營(yíng)養(yǎng)液的pH進(jìn)行了優(yōu)化，確定了營(yíng)養(yǎng)液的最佳pH，在最佳pH條件下，洛伐他汀的產(chǎn)量較高，且發(fā)酵過程中無(wú)桔青霉產(chǎn)生，這為工業(yè)上紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀提供了思路。

令人遺憾的是，該菌種在該工藝條件下，紅曲色素含量太低。《GB 1886.19—2015》[6]對(duì)功能性紅曲粉的色價(jià)要求是大于等于1 000，而本試驗(yàn)中紅曲粉色價(jià)在100左右，雖然隨著pH的變化有所變化，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)紅曲色素含量的要求。紅曲色素為紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的天然色素，符合食品著色劑“天然、營(yíng)養(yǎng)、多功能”的發(fā)展方向，具有很好的應(yīng)用前景[11-12]，如何通過改良菌種或改善代謝條件，得到洛伐他汀和紅曲色素均高產(chǎn)的工藝值得研究。◇

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[7]GB/T 5009.222-2008.紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測(cè)定[S].

[8]廖南清.群感效應(yīng)對(duì)紅曲霉洛伐他汀和紅曲色素合成的影響及調(diào)控機(jī)制研究[D]. 廣州：廣東藥學(xué)院，2015.

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[12]陸磊，劉秀河.功能性紅曲米發(fā)酵工藝與控制[J]. 山東食品發(fā)酵，2013(4)：9-11.

(責(zé)任編輯 李婷婷)

The Optimum pH Value of Functional Solid Fermentation of Monascus Nutrient Solution for Best Yield of Lovastatin

QI Wen-wu， CHEN Xiao-yun， ZHENG Shi-mao， PANG Xin

(Beijing Dawn Aerospace Bio-tech CO.LTD，Beijing 101400，China)

functional monascus；lovastatin；solid-state fermentation；optimum pH；nutrient solution

齊文武(1988— )，男，學(xué)士，研究方向：保健食品與食用菌開發(fā)。

龐欣(1970— )，女，博士，研究方向：保健食品與食用菌開發(fā)。