利拉魯肽對糖尿病模型大鼠腎臟組織核因子-κB、單核細胞趨化蛋白-1和血管細胞間黏附分子-1表達的影響

興桂華 張 健 何 靜 孫筱竹 付永麗

(齊齊哈爾醫學院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

利拉魯肽對糖尿病模型大鼠腎臟組織核因子-κB、單核細胞趨化蛋白-1和血管細胞間黏附分子-1表達的影響

興桂華 張 健1何 靜1孫筱竹1付永麗1

(齊齊哈爾醫學院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 探討利拉魯肽對糖尿病(DM)大鼠腎臟組織核因子(NF)-κB、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1和血管細胞間黏附分子(VCAM)-1表達的影響。方法 選用8周齡雄性SD大鼠54只，隨機分為正常對照組、模型組、胰島素對照組和利拉魯肽低、中、高劑量組(100、200和300 μg·kg-1·d-1)，采用高脂高糖飼料喂養大鼠4 w后，再給予鏈脲佐菌素(STZ)35 mg/kg腹腔注射建立動物模型。藥物干預8 w后測定血糖、血肌酐和尿素氮等生化指標改變。采用免疫組織化學SP方法和病理圖像定量分析技術檢測大鼠腎組織NF-κB、MCP-1和VCAM-1的表達水平。結果 與模型組相比，胰島素對照組及利拉魯肽各劑量組大鼠血肌酐、血尿素氮、尿白蛋白/肌酐均明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，利拉魯肽各劑量組腎組織NF-κB、MCP-1和VCAM-1的表達降低(P<0.05)。結論 利拉魯肽通過下調DM大鼠腎臟組織NF-κB、MCP-1和VCAM-1表達，發揮對腎小球毛細血管內皮細胞的保護作用，從而改善DM大鼠腎損傷。

利拉魯肽；糖尿病；單核細胞趨化蛋白；血管細胞間黏附分子；核因子-κB

糖尿病(DM)腎病(DN)是DM并發癥之一，有極高的致殘率和致死率。研究證實〔1〕，胰高血糖素樣肽(GLP)-1可改善DM患者血管內皮功能。GLP-1受體激動劑利拉魯肽是副作用較少的、新型的治療DM的藥物，研究發現，利拉魯肽治療可延緩DM患者腎損傷的進展〔2〕。本課題組成功建立DM動物模型，應用利拉魯肽干預治療后，通過免疫組化方法檢測核因子(NF)-κB、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1和血管細胞間黏附分子(VCAM)-1的表達，觀察利拉魯肽除降糖作用外是否對DM模型大鼠腎小球毛細血管內皮細胞具有保護作用，從而探討利拉魯肽改善DM大鼠腎損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雄性8周齡SD大鼠54只，體重180～200 g，購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，許可證編號SCXK(吉)2014-0004。藥物與主要試劑：鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma，USA；利拉魯肽注射液購于諾和諾德(中國)制藥有限公司；大鼠胰島素試劑盒購自美國Linco公司。兔抗鼠MCP-1、NF-κB和VCAM-1多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司，免疫組化SP法檢測試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。主要儀器：羅氏血糖儀(ACCU-CHEK，USA)，日立7020型全自動生化分析儀(日本日立公司)，離心機(Hamburg)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 大鼠適應性飼養1 w后隨機分為正常對照組、模型組、胰島素對照組和利拉魯肽低、中、高劑量組，每組9只。造模方法：將大鼠適應性喂養1 w后，模型組大鼠給予高脂高糖飼料喂養4 w后，再給予STZ 35 mg/kg腹腔注射，建立DM大鼠模型，胰島素對照組給予地特胰島素3～5 IU/d皮下注射，利拉魯肽低、中、高劑量組分別腹部皮下注射100、200、300 μg·kg-1·d-1；模型組及正常對照組給予生理鹽水3～5 ml/d皮下注射；共計干預8 w。

1.2.2 指標檢測 實驗結束前1 d，每組取9只大鼠，代謝籠收集24 h尿液，計數24 h尿量，采用免疫比濁法測定24 h微量白蛋白；所有大鼠禁食12 h，從眼外眥處取空腹血，采用自動生化分析儀檢測血尿素氮和肌酐。

1.2.3 NF-κB、MCP-1和VCAM-1免疫組化檢測 隨機選9只大鼠斷頭處死，迅速取出腎組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚約3 μm。采用免疫組化SP方法，嚴格按試劑說明書進行操作，主要操作步驟：滴加兔抗鼠多克隆抗體MCP-1、兔抗鼠多克隆抗體NF-κB和兔抗鼠多克隆抗體VCAM-1，4℃冰箱過夜。滴加生物素化二抗工作液37℃孵育20 min。滴加鏈霉卵蛋白37℃孵育20 min。DAB顯色。蘇木素復染，中性樹膠封片。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。光鏡下觀察，并用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統分別進行NF-κB、MCP-1和VCAM-1半定量評分〔3〕：每張切片隨機選取10個腎小球，在高倍鏡(×400)視野下陽性表達呈棕褐色。NF-κB、MCP-1和VCAM-1表達水平采取陽性染色面積評分與陽性染色強度評分的乘積表示。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、SNK檢驗。

2 結 果

2.1 利拉魯肽對DM模型大鼠腎功能和尿白蛋白/肌酐的影響 利拉魯肽干預8 w后，與正常對照組相比，模型組血肌酐、血尿素氮和尿白蛋白/肌酐均顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，利拉魯肽各劑量組和胰島素對照組血肌酐、血尿素氮、尿白蛋白/肌酐均降低(P<0.05)，見表1。

表1 利拉魯肽對DM模型大鼠腎功能和尿白蛋白/肌酐的影響

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 利拉魯肽對DM模型大鼠腎臟組織NF-κB、MCP-1和VCAM-1表達的影響 免疫組化結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠腎組織毛細血管內皮NF-κB、MCP-1和VCAM-1表達均升高；與模型組相比，胰島素對照組及利拉魯肽各劑量組NF-κB、MCP-1和VCAM-1表達明顯減少(P<0.05)。見表2。

表2 利拉魯肽對DM模型大鼠腎臟組織MCP-1、NF-κB和VCAM-1表達的影響

3 討 論

DN是目前引起終末期腎衰竭的主要原因〔4〕。有研究認為，DM是一種慢性炎性反應疾病，炎性因子在DN的發生發展中發揮著重要作用〔5〕。NF-κB是一種重要的核轉錄因子，參與體內多種基因的調控和轉錄，在DN中發生發展的作用日益引起重視。最新研究顯示，高糖誘導下2型DM大鼠腎組織中NF-κB 活性增強進一步加劇了腎損傷，并且通過激活NF-κB可誘導血管內皮細胞表達MCP-1〔6〕。MCP-1作為NF-κB的下游細胞因子，是一種特異性的單核/巨噬細胞趨化因子，在DN 發病機制中起重要作用〔7〕。近年來的研究〔8〕顯示MCP-1與DM微血管病變密切相關，DN中單核/巨噬細胞的廣泛浸潤可引起細胞外基質堆積、基底膜增厚，從而發展為腎小球硬化和間質纖維化，某些抗MCP-1措施可減輕DM腎損傷。VCAM-1 屬黏附分子中免疫球蛋白超家族成員，VCAM-1 基因的表達主要由轉錄因子NF-κB 控制，VCAM-1與整合素家族的遲出現的抗原(α4β1)結合后，導致構型改變，都成為高親和力的黏附分子，從而處于活化狀態。已往有研究表明，VCAM-1與DM及其慢性并發癥密切相關〔9〕。

近年來，DN的標準治療主要包括阻斷腎素血管緊張素系統控制血壓及控制血糖。利拉魯肽是副作用較少的、新型的治療DM的GLP-1類似藥物，具有降血糖、抑制胰高血糖素、延緩胃排空及減輕體質量等作用〔2〕。研究表明，利拉魯肽在改善DM大鼠血管內皮功能方面優越于傳統降糖藥〔10〕。新近研究發現，利拉魯肽可抑制胰島素抵抗大鼠腎組織NF-κB、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6的表達，可能參與腎功能改善〔11〕。本實驗結果表明利拉魯肽可能通過下調DM大鼠腎組織MCP-1和NF-κB的表達，從而改善DM微血管病變。另外本研究還表明利拉魯肽可能通過降低腎組織VCAM-1的表達，以發揮對DM模型大鼠腎臟的保護作用。

1 Hu Y，Liu H，Simpson RW，etal.GLP-1-dependent and independent effects and molecular mechanisms of a dipetidyl peptidase 4 inhibitor in vascular endothelial cells〔J〕.Mol Biol Rep，2013；40(3)：2273-9.

2 Imamura S,Hirai K，Hirai A.The glucagon-like peptide-1 receptor agonist，liraglutide，attenuates the progression of overt diabetic nephropathy in type 2 diabetic patients〔J〕.Tohoku J Exp Med，2013；231(1):57-61.

3 李 穎，夏 天，李 榮.吡格列酮對KKAy小鼠腎臟的保護作用及其機制探討〔J〕.中華糖尿病雜志，2015；10(7)：639-44.

4 Zhou G，Li C,Cai L.Advanced glycatiod end-products induce connective tissue growth factor-mediated renal fibrosis predominantly through transforming growth factor beta-independent pathway〔J〕.Am J Pathol，2004；165：2033-43.

5 Navarro-Gonzalez JF，Mora-Fernandez C.The role inflammatory cytokines in diabetic nephyropathy〔J〕.J Am Soc Nephrol，2008；19：433-42.

6 Fujii T，Yonemitsu Y，Onimaru M，etal.Nonendothelial mesenchymal cell derived MCP-1 is required for FGF2 mediated therapeutic neovascularization：critical role of the inflammatory/arteriogenic pathway〔J〕.Arterioseler Thromb Vasc Biol，2006；26(11)：2483-9.

7 Giunti S，Barutta F，Perin PC，etal.Targeting the MCP-1/CCR2 system in diabetic kidney disease〔J〕.Curr Vasc Pharmacol，2010；8(6)：849-60.

8 Tone A，Shikata K，Nakagawa K，etal.Renoprotective effects of clarthromycin via reduction of urinary MCP-1 levels in type 2 diabetic patients 〔J〕.Clin Exp Nephrol，2011；15(1)：79-85.

9 Fasching P，Voitl M.Elevated concentrations of circulating adhesion molecules ane their association with microvascular complacation in insulin-dependent diabetes mellitus〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，1996；81：4313-7.

10 綦才輝，金勇君，楊美子，等.利拉魯肽對2型糖尿病大鼠NF-κB及VCAM-1表達的影響〔J〕.山東大學學報(醫學版)，2014；52(4)：39-42.

11 吳曉靜，胡桂才，高 宇，等.利拉魯肽對胰島素抵抗大鼠腎臟NF-κB及炎癥因子表達的影響〔J〕.實用醫學雜志，2016；32(18)：3000-3.

〔2016-11-09修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)

齊齊哈爾市科技計劃項目(No.SFGG-201524);齊齊哈爾醫學院院內科研基金項目(QY2016M-04)

張 健(1968-)，女，主任醫師，教授，主要從事糖尿病臨床藥物治療研究。

興桂華(1969-)，女，碩士，主任醫師，教授，主要從事糖尿病腎病的基礎研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)09-2119-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.016

1 齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院內分泌科