持續(xù)性與間歇性低載荷機(jī)械振動(dòng)對成骨細(xì)胞增殖與分化的影響

趙 濱 譚 磊 郝寶輝 王林祥 喬偉松 陳玉穎 劉 超 李 晨 朱 東

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

持續(xù)性與間歇性低載荷機(jī)械振動(dòng)對成骨細(xì)胞增殖與分化的影響

趙 濱 譚 磊 郝寶輝 王林祥 喬偉松 陳玉穎1劉 超 李 晨 朱 東

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

目的 觀察不同低載荷振動(dòng)方式對成骨細(xì)胞增殖與分化的影響。方法 應(yīng)用振動(dòng)加載器給予培養(yǎng)的成骨細(xì)胞MC3T3-E1以強(qiáng)度為0.25 g、頻率35 Hz的振動(dòng)載荷，設(shè)置空白組(A組)，持續(xù)振動(dòng)10 min(B組)及振動(dòng)5 min間歇5 min再振動(dòng)5 min(C組)兩種加載模式組，加載結(jié)束后分別檢測各組MC3T3-E1細(xì)胞的增殖能力(CCK-8法)、堿性磷酸酶(ALP)活性及Runx-2蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果 3組之間成骨細(xì)胞增殖情況無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.742)，B組與C組ALP活性及Runx-2蛋白的表達(dá)明顯高于A組，C組的ALP活性及Runx-2蛋白的表達(dá)顯著高于B組(P<0.05)。結(jié)論 低載荷機(jī)械振動(dòng)對成骨細(xì)胞的增殖并無影響，然而低載荷機(jī)械振動(dòng)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，特別是適當(dāng)?shù)拈g歇低載荷機(jī)械振動(dòng)能夠更加明顯的促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。

持續(xù)性低載荷機(jī)械振動(dòng)；間歇性低載荷振動(dòng)；成骨細(xì)胞；增殖；分化

骨質(zhì)疏松引起的公共健康負(fù)擔(dān)一直居高不下，特別是低能量損傷使得老年骨質(zhì)疏松患者罹患骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加，同時(shí)其引發(fā)的高殘障率和死亡率已成為一項(xiàng)嚴(yán)重的公共健康威脅〔1〕。目前為止，關(guān)于防治骨質(zhì)疏松的研究主要有以下幾個(gè)方面〔2～4〕：電刺激、低強(qiáng)度脈沖超聲波、體外沖擊波療法、高能震蕩波、高壓氧吸入、叩擊式骨應(yīng)力刺激儀、針刺療法、中藥熏洗加關(guān)節(jié)松動(dòng)訓(xùn)練等，但這些方法的治療效果并非令人完全滿意且尚存在一定的爭議。研究表明，低載荷(頻率32～37 Hz，加速度0.2～0.3 g)振動(dòng)能夠促進(jìn)骨的生長并對抗骨質(zhì)疏松〔5～8〕。然而以上諸多研究都是通過各種不同的持續(xù)加載方式作用于研究對象，本研究將通過對成骨細(xì)胞施加間歇性的低載荷振動(dòng)來研究間歇的加載是否會(huì)產(chǎn)生不同的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1購買自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，α-MEM(HYCLONE，美國)，新生牛血清(杭州四季青生物公司)，CCK-8試劑盒(南京凱基生物有限公司)，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司)，Runx-2鼠單克隆抗體(Abcam，美國)，羊抗小鼠二抗(博奧森，北京)，GAPDH內(nèi)參(博奧森，北京)，一次性細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，美國)。

1.2 成骨細(xì)胞的培養(yǎng) 將成骨細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)瓶放置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次，細(xì)胞生長至鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%時(shí)按照1∶3傳代。

1.3 細(xì)胞加載與分組 待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長至鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%時(shí)，換成不含血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h以同步化細(xì)胞，然后將細(xì)胞消化，吹打均勻后用含血清培養(yǎng)基稀釋60倍接種于6孔空培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將接種于6孔板的細(xì)胞分為3組：空白組(A組)，持續(xù)振動(dòng)10 min(B組)，振動(dòng)5 min間歇5 min再振動(dòng)5 min(C組)；其中B、C組均給予強(qiáng)度0.25 g，頻率35 Hz的振動(dòng)載荷。

1.4 成骨細(xì)胞增殖檢測 分別檢測加載3、5、7 d時(shí)成骨細(xì)胞的增殖情況。將各組細(xì)胞消化后制成等體積的細(xì)胞混懸液，按照說明書檢測各組在450 nm處的吸光度。計(jì)算各組細(xì)胞活力，最終與A組相比。

1.5 成骨細(xì)胞ALP活性檢測 每天按照預(yù)定的加載方式加載成骨細(xì)胞，待觀測到細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底面積的80%后終止加載。將成骨細(xì)胞消化、離心并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。將離心好的細(xì)胞加入200 μl含0.1% Triton X-100細(xì)胞裂解液，吹打均勻，4℃裂解12 h，然后用超聲細(xì)胞破碎儀再次處理細(xì)胞。將處理好的樣本按照給定的操作步驟檢測各組ALP活性。

1.6 Runx-2蛋白表達(dá)的檢測 每天按照預(yù)定的加載方式加載成骨細(xì)胞，待觀測到細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底面積的80%后終止加載。消化、洗滌并離心收集細(xì)胞。RIPA強(qiáng)效裂解液冰上裂解細(xì)胞20 min，15 000 r/min離心20 min后取上清，并檢測蛋白濃度。各組樣品加入上樣緩沖液100℃加熱10 min備用。配制分離膠及濃縮膠，每孔上樣20 μg蛋白樣本，電泳濃縮膠45 min，分離膠45 min，濕法轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，1∶1 000一抗4℃孵育過夜，充分洗膜3次，1∶5 000二抗室溫孵育1 h，充分洗膜3次后顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同加載方式對成骨細(xì)胞增殖的影響 分別檢測各組在加載3、5、7 d后成骨細(xì)胞增殖情況(見圖1)。A、B、C 3組之間的細(xì)胞增殖相比差異并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.742)。

圖1 不同加載方式對成骨細(xì)胞增殖的影響

2.2 不同加載方式對成骨細(xì)胞ALP活性及Runx-2蛋白表達(dá)的影響 B、C組在接受低載荷的振動(dòng)加載后，ALP活性〔(9.51±1.05)U/ml、(16.70±1.44)U/ml〕及Runx-2(47 801、98 471)較A組〔(5.03±0.96)U/ml，35 673〕有明顯的升高(P<0.05)，C組明顯高于B組(P<0.05)。

3 討 論

老年性骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為一項(xiàng)嚴(yán)重威脅老年人健康的疾病，Rubin教授早期將低載荷機(jī)械振動(dòng)用于骨科治療及康復(fù)領(lǐng)域，他通過大鼠、羊、火雞等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低載荷機(jī)械振動(dòng)可以促進(jìn)骨細(xì)胞生長，拓展了這種機(jī)械加載方法在治療骨科疾病方面的應(yīng)用價(jià)值〔5，8，9〕。

成骨細(xì)胞是在成骨過程中起調(diào)控作用的關(guān)鍵細(xì)胞〔10〕。在成骨過程中，成骨細(xì)胞的增殖與分化是兩個(gè)非常關(guān)鍵的步驟，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示在成骨細(xì)胞增殖方面，A、B、C三組之間并未出現(xiàn)明顯的差異，然而關(guān)于力學(xué)加載對于成骨細(xì)胞增殖具體會(huì)產(chǎn)生哪種影響目前仍然存在爭議，但是我們認(rèn)為產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與細(xì)胞種類、力學(xué)加載類型有關(guān)，這仍需要進(jìn)一步研究。ALP是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志因子〔11〕，Runx-2蛋白被認(rèn)為是調(diào)節(jié)骨平衡響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷的關(guān)鍵因子〔12，13〕，因此通過檢測ALP及Runx-2的變化可以初步檢測成骨細(xì)胞的分化情況。我們的研究發(fā)現(xiàn)，C與B兩組在受到低載荷機(jī)械振動(dòng)加載后，其ALP活性及Runx-2的表達(dá)均較A組有顯著升高，這與以往的研究吻合。

本研究結(jié)果的振動(dòng)加載所產(chǎn)生的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的效果優(yōu)于持續(xù)的振動(dòng)加載。產(chǎn)生這種結(jié)果可能是因?yàn)槌晒羌?xì)胞在接受力學(xué)刺激一定時(shí)間后產(chǎn)生了疲勞或者是適應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致其不能進(jìn)一步對力學(xué)信號產(chǎn)生響應(yīng)。當(dāng)我們停止力學(xué)刺激一定時(shí)間后，成骨細(xì)胞得到休息不再疲勞或者是再次恢復(fù)其對力學(xué)刺激的敏感性，其后再次接受力學(xué)刺激后能夠再次響應(yīng)，較持續(xù)振動(dòng)相同時(shí)間產(chǎn)生更明顯的效果，但是這種猜測需要深入研究。

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〔2016-09-09修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學(xué)基金資助(No.11432016,11272134,11602093)

朱 東(1941-)，男，教授，主要從事四肢骨折的治療骨生物力學(xué)研究。

趙 濱(1990-)，男，碩士，主要從事四肢骨折的治療骨生物力學(xué)研究。

R681

A

1005-9202(2017)09-2084-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.002

1 大連醫(yī)科大學(xué)