ω-3多不飽和脂肪酸對去勢大鼠骨微結構的改善

楊敏 蔣紅櫻 何振坤 曾怡 白彝華* 陳良敬

1. 昆明醫科大學第二附屬醫院腎臟內科，云南 昆明 650101 2. 溫州市中心醫院外科，浙江 溫州 325000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減低和骨微結構退化導致骨脆性增加,骨折風險性增加為特征的一種疾病[1]。絕經后OP是骨質疏松癥中最常見類型，與雌激素缺乏有關，并且約有 40%-50% 的50歲以上婦女可能發生絕經后骨質疏松性骨折[2]，嚴重影響絕經后女性健康。目前尚無有效的方法再生已經丟失的骨小梁，因此，有效地延緩骨量減少速度，對預防絕經后女性骨質疏松癥和脆性骨折意義重大。ω-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)來源于深海冷水魚類(如鮭魚、鯖魚、蹲魚、金槍魚等)，安全無毒，主要成員有二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)，目前在臨床方面主要用于降脂、抗凝、免疫營養支持和抗炎等[3]。近期有研究表明，骨代謝[4]、骨質疏松[5]與ω-3 PUFA關系密切。骨強度取決于骨密度和骨質量，骨強度下降是OP的根本特點。但是骨密度僅反映了骨強度的70%[1]，并不能體現骨微結構，而后者是骨脆性的決定因素，可獨立于骨密度而起作用[6]。目前的研究多限于ω-3 PUFA對骨密度及生物力學指標的影響[7,8]，有關ω-3 PUFA對骨微結構影響的研究極少。因此，本研究擬以去勢雌性大鼠為研究對象，觀察ω-3 PUFA對去勢大鼠骨微結構的影響，為更好地防治絕經后骨質疏松提供一定的實驗支持。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF級11 w齡雌性大鼠30只，體重250±25 g，實驗動物由上海西普爾-必凱實驗動物公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(滬)2006-0010；動物使用許可證號：SXK(滬)2006-0010。整個實驗中，所有大鼠自由進食和飲水，使用標準飼料，其中鈣含量為1.33%，磷含量為0.95%。動物飼養環境溫度為25±2℃，相對濕度50%～70%，12 h晝夜循環周期。ω-3 PUFA采用多烯酸乙酯膠丸，每粒含EPA乙酯和DHA乙酯(0.25g/丸)。國藥準字H20003082，由廈門魚肝油廠制造，產品批號為11354001。雌二醇(E2)試劑盒購于北京北方生物技術研究所。

1.2 分組及模型構建

所有雌性SD大鼠適應性喂養1 w后隨機分為假手術組、模型組和實驗組3組，每組10只。假手術組僅切除卵巢周圍脂肪組織(卵巢大小)，其余兩組切除雙側卵巢。

1.3 實驗干預

術后恢復2 w開始干預。模型組和假手術組給予生理鹽水灌胃，量為1 mL/(100 g·d)，實驗組給予ω-3 PUFA，量為150 mg/(kg·d)，此劑量可改善生物力學性能、改善骨質高轉換狀態[8,9]。ω-3 PUFA與生理鹽水混合，按照1 mL/(100g·d)的量灌胃，干預12 w。每周稱量1次空腹體重，按體重調整用藥量。

1.4 指標檢測

干預12 w后，處死所有大鼠，經下腔靜脈采血，4℃離心分離血清用于檢測血鈣、磷、堿性磷酸酶(ALP)和雌激素水平。鈣、磷、ALP應用日本日立7080全自動生化分析儀測定。雌二醇采用放射免疫法測定，嚴格按使用說明操作。完整分離右側整段股骨，剔除肌肉組織，10%甲醛固定液固定24 h，轉75%乙醇過夜，應用micro-CT檢測骨密度和骨微結構參數，后者包括松質骨骨微結構參數(骨小梁體積比率(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.n)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁間隙(Tb.sp)和皮質骨骨微結構參數(皮質體積比率(BV/TV)、皮質厚度(Cor·Th)和皮質骨的孔隙率。

1.5 統計學方法

使用SPSS16.0做統計分析，連續變量用平均數±標準差表示。在滿足總體方差齊性、樣本獨立及正態分布的前提下，按照one-way ANOVA的方法對總體均數進行統計分析，兩兩比較采用SNK法。所有的檢驗均為雙側檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

實驗過程中，假手術組1只大鼠因術后感染死亡，模型組1只大鼠因麻醉藥誤入下腔靜脈死亡，其余大鼠術后恢復及生活狀態良好。實驗結束時，各組大鼠總數為假手術組9只，模型組9只，實驗組10只。

2.2 各組之間骨代謝指標和E2比較

各組大鼠血清鈣、磷無顯著性差異。模型組、實驗組ALP水平均顯著高于假手術組，見表1。E2在3組之間存在顯著差異，表現為模型組水平最低，而假手術組水平最高，見表1。

表1 3組大鼠骨代謝指標和雌二醇比較±s)Table 1 Comparison of bone metabolism indexes and estradiol levels among three groups (±s)

注：ALP：堿性磷酸酶；與假手術組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05

Note:ALP:alkaline phosphatase; compared with Sham operation group，aP<0.05; compared with model，bP<0.05

2.3 ω-3PUFA對松質骨骨密度和骨微結構的影響

實驗組松質骨骨密度、BV/TV、Tb.Th和Tb.N均顯著低于假手術組，而Tb.Sp顯著高于假手術組；實驗組松質骨骨密度、BV/TV、Tb.Th和Tb.N均顯著高于模型組，而Tb.Sp顯著低于模型組，見表2。

表2 3組大鼠松質骨骨密度及骨微結構指標比較±s)Table 2 Comparison of bone mineral density and microstructure of cancellous bone among three groups(±s)

注：BV/TV：骨小梁體積比率；Tb.Th：骨小梁厚度；Tb.N：骨小梁數目；Tb.Sp：骨小梁間隙；與假手術組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05

Note:BV/TV:Trabecular bone volume ratio; Tb.N:trabecular number;aP<0.05,compared with Sham operation group;bP<0.05,compared with model

2.4 ω-3PUFA對皮質骨骨密度和骨微結構的影響

實驗組皮質骨骨密度、BV/TV和Cr.Th均顯著低于假手術組，而孔隙率顯著高于假手術組；實驗組皮質骨骨密度、BV/TV和Cr.Th均顯著高于模型組，而孔隙率顯著低于模型組，見表3。

表3 3組大鼠皮質骨骨密度及骨微結構指標比較±s)Table 3 Comparison of bone mineral density and bone microstructure among three groups(±s)

注：BV/TV：骨皮質體積比率；Cr.Th：皮質厚度；與假手術組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05

Note:BV/TV:Trabecular bone volume ratio; Cr.Th:cortical thickness;aP<0.05,compared with Sham operation group;bP<0.05,compared with model

3 討論

絕經后雌激素水平降低，雌激素的缺乏破壞了骨吸收和骨形成的平衡，導致骨吸收速度超過骨形成速度，因此絕經后骨質疏松癥屬于高轉換型骨質疏松。在本研究中，血清鈣磷水平無差異，而模型組的ALP水平顯著升高，提示骨形成增加，符合絕經后骨質疏松的機制[1]。隨著對骨質疏松機制認識的加深，治療骨質疏松癥的藥物研究也在不斷深入和完善。ω-3PUFA屬長鏈不飽和脂肪酸，目前在臨床方面主要用于降脂、抗凝、免疫營養支持和抗炎等[3]。近期有ω-3PUFA治療骨質疏松的報道，但是多從骨密度和營養的角度分析[7,9]。本實驗以去勢大鼠骨微結構作為切入點，探討ω-3PUFA對骨質疏松癥的防治作用。

高分辨率micro-CT是用于實驗室測量末梢骨的超高分辨率CT掃描機，可顯示橈骨和脛骨的小梁骨結構，并可對骨組織進行影像學三維重建和形態結構的分析，獲取描述骨內部微結構的參數。micro-CT所測的骨微結構參數指標如骨容積、骨小梁數目等能夠非常靈敏地反映骨質疏松的早期改變，甚至要早于傳統的骨組織計量學的相應指標[6]。本研究即是應用該技術對3組大鼠的股骨進行掃描、重構和分析，測量其骨密度、皮質骨和松質骨骨微結構變化。結果表明，無論是松質骨還是皮質骨，實驗組大鼠的骨量減少較模型組輕，這與近期國內外的研究[7,8,10]結果相似。本研究的一個重要結果是發現實驗組骨微結構顯著優于模型組，從骨微結構的角度證實ω-3PUFA對于骨質疏松的防治作用。通過降低骨量丟失和改善骨微結構，ω-3PUFA可改善骨礦密度和骨質量，從而提高骨強度，這對于預防骨質疏松及其最常見并發癥脆性骨折均具有重要意義。國外已有動物實驗[11]表明，ω-3 PUFA能夠增加蛋雞的骨強度，減少骨折發生。將來可進行臨床試驗進一步證實。

ω-3PUFA改善骨礦密度和骨質量的確切機制并不明確。Yao等[10]以去卵巢大鼠為研究對象并體外培養其破骨細胞，發現ω-3PUFA能夠顯著降低其抗酒石酸酸性磷酸酶活性，提示抑制破骨細胞的產生和活性可能是ω-3PUFA延緩去卵巢大鼠骨丟失的機制之一。Watkins 等[12]發現用EPA干預前成骨細胞系細胞MC3T3-E1 48 h后其骨形成標記物堿性磷酸酶水平顯著高于花生四烯酸，提示促進成骨細胞作用可能是ω-3PUFA改善骨量和骨微結構的另一機制。本研究比較了3組大鼠的雌激素水平，發現實驗組的雌激素水平較模型組有所改善，與錢康[7]的研究結果相似，提示改善雌激素水平也是ω-3PUFA防止骨質疏松的機制之一。

總之，本研究表明，ω-3 PUFA對去卵巢大鼠的骨微結構有一定的改善作用，這對于防治骨質疏松具有一定的意義。