混合菌群發酵馬尾藻作為海藻肥料的研究

王明鵬, 陳 蕾, 劉正一, 王學江, 秦 松, 閆培生, 3

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混合菌群發酵馬尾藻作為海藻肥料的研究

王明鵬1, 陳 蕾2, 劉正一2, 王學江4, 秦 松2, 閆培生1, 3

(1. 哈爾濱工業大學市政環境工程學院, 黑龍江哈爾濱 150090; 2. 中國科學院煙臺海岸帶研究所, 山東煙臺 264003; 3. 哈爾濱工業大學海洋科學與技術學院, 山東威海 264209; 4. 五洲豐農業科技有限公司, 山東煙臺 264000)

從馬尾藻原位分離發酵菌群, 采用分子生物學手段分析鑒定菌種組成, 獲得發酵菌株4株分別為巨大芽孢桿菌(), 非脫羧勒克氏菌(), 鞘氨醇單胞菌()以及賴氨酸芽孢桿菌(); 控制4菌株接種比例進行馬尾藻發酵, 監測發酵過程中菌種生物量、褐藻酸含量及褐藻寡糖含量變化規律, 結果表明, 馬尾藻經發酵36 h生成聚合度2-5的褐藻寡糖, 并伴隨菌種二次生長及pH下降等易于觀察檢測的參數變化; 含褐藻寡糖的發酵原液稀釋600倍后, 能夠明顯促進小麥種子萌發及根生長, 與清水對照相比萌發率提高26%, 根系長度增長37%。本研究為微生物發酵法生產海藻肥料提供了可行案例, 證實該方法簡單有效, 可操作性強, 有廣闊的應用前景, 為將來實現海藻發酵肥工業化生產提供理論支持和數據支撐。

發酵; 馬尾藻; 褐藻寡糖; 促生長

公元4世紀已有海藻用作土壤肥料的記載。海藻富含多種營養物質, 能夠改善土壤并對植物生長產生有益功效, 加之獲取方便, 成本低廉, 常被人們用作天然有機肥料[1]。目前, 海藻肥料已經實現商品化, 全球范圍內有眾多海藻肥生產廠家。根據國際農業行業權威雜志New AG International對以海藻為主原料的海藻肥市場統計, 2012年, 在歐洲市場上, 海藻肥經濟價值20億~40億歐元, 全球預計最低為80億歐元, 僅占整個農資市場(含化肥、殺蟲殺菌市場)總額的2%, 海藻肥在農業上的經濟價值空間巨大[2]。

據統計, 2012年全世界海藻產量接近2 490萬噸, 其中有相當比例的海藻作為生長促進劑及土壤調節劑被應用于種植領域[3]。大型海藻主要分為紅藻、綠藻、褐藻三大門類, 其中褐藻是全球范圍內應用最為廣泛的海藻肥生產原料, 包括海帶、馬尾藻、泡葉藻、巨藻等[4]。褐藻與其他藻類相比有其獨特的營養成分, 比如褐藻酸、褐藻糖膠、褐藻多糖等。褐藻酸是褐藻細胞壁的主要組成成分, 含量占褐藻干質量的20%~40%。褐藻酸由甘露糖醛酸和古羅糖醛酸單體通過1→4糖苷鍵連接組成長鏈大分子結構, 并且與褐藻糖膠、多酚、蛋白質等成分相互交聯形成網絡, 對支撐和維持細胞壁骨架結構起決定性作用[5-6]。如何將海藻中的營養物質高效提取利用, 同時最大限度地保障其活性在加工過程中不被破壞是海藻肥料制造領域需要突破的關鍵技術。然而, 褐藻細胞壁的復雜結構和堅韌特性是阻礙海藻細胞內活性物質釋放的最大障礙。因此, 我們的需求就是分解褐藻酸這一關鍵成分的大分子結構, 進而瓦解海藻細胞壁, 促使海藻細胞中的營養物質的釋放。目前,海藻肥制備方法主要是依賴酸、堿及化學有機試劑等對海藻原料進行提取, 該方法雖然簡單但是易造成藻肥活性物質的不可逆性破壞, 同時酸、堿、有機試劑成分殘留在海藻肥產品中, 會對農作物及土壤環境造成危害。物理法對儀器設備要求嚴苛, 成本較高, 難以實現行業推廣[7]。因此, 海藻肥生產廠家需要尋找更為環保高效的生產方法。

微生物發酵是一種反應溫和, 簡單可控, 安全環保的生物反應過程。自古以來, 人們已經利用微生物發酵生產出多種產品, 但是利用微生物發酵海藻的研究主要集中在生產生物質乙醇和抗性天然產物[8-10],利用微生物發酵法生產海藻肥料的研究相對較少。國內相關的幾例研究是選用傳統發酵微生物比如酵母, 乳酸菌等混合菌群對海藻原料進行類似堆肥發酵或好氧發酵處理。但其發酵過程可控性差, 發酵周期長, 目標產物不明確, 難以滿足工業化生產要求的統一, 穩定, 可控的標準, 產品的質量難以保障[11-13]。發酵海藻的微生物, 因此, 本文擬從解決上述問題入手, 針對性地分離篩選特種發酵菌株, 對馬尾藻進行微生物發酵處理, 并對其發酵過程及產物功效進行初步研究, 探索微生物發酵生產海藻肥的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

馬尾藻樣品采自山東長島, 采集新鮮海藻裝入自封袋后放入冰盒, 運回實驗室后置于4℃冷柜保存。馬尾藻經沖洗去除表面的沙粒、貝殼等雜質, 置于60℃烘干后, 研磨成粉末, 按照1︰20(/)與蒸餾水混合, 于121℃滅菌處理20 min, 冷卻后離心獲得海藻的熱水浸提液(SWE培養基), 加入2%瓊脂, 滅菌倒平板, 制成馬尾藻平板。

1.2 菌株的篩選與鑒定

新鮮海藻剪成3~5 cm的片段, 置于無菌三角瓶中, 瓶底加少量無菌2216E培養基, 封口后三角瓶置于30℃溫箱培養, 待2~3周后, 將海藻片段表面附生的菌苔刮下, 用無菌水梯度稀釋后, 涂布馬尾藻平板。

1.2.1 菌株革蘭氏染色

挑取平板上生長24 h的新鮮菌落, 涂抹在載玻片中央的清水滴中, 用酒精燈火焰將水分輕輕烤干。菌體細胞固定后, 結晶紫染色1 min, 用自來水沖洗, 碘液媒染1 min, 自來水沖洗, 吸干水分, 加95%酒精數滴, 并輕輕搖動進行脫色, 20 s后水洗, 吸去水分, 最后加番紅染色1 min, 自來水沖洗, 干燥后鏡檢。

1.2.2 菌株分子鑒定

挑取馬尾藻平板上不同形態的單菌落, 接種于2216E培養基中, 過夜培養, 取1 mL菌液提取基因組DNA, 用27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)通用引物擴增16SrDNA, 將PCR產物送至英濰捷基公司測序。各菌株的16S rDNA序列經比對后用MEGA 5.1軟件構建系統進化樹。

1.3 菌株發酵

4株菌株分別經2216E培養基培養12~16 h, 測定600 nm處吸光值, 用無菌水分別調節OD600值至1.0, 將調好的4種菌懸液混合, 按照1%的接種比例將混合菌液轉接至馬尾藻液體培養基(SWE培養基), 30℃, 200 r/m培養。每隔4 h取樣, 測定馬尾藻發酵液OD600值, pH值和褐藻酸含量。另外, 發酵結束后, 取5個5 mL離心管, 各管內加入0.3 mL馬尾藻發酵液和2.7 mL馬尾藻水提液, 置于30℃培養, 分別在0、1、3、5、7 h各取出一管, 測定管內褐藻酸含量。

1.4 褐藻酸含量檢測

發酵液中褐藻酸含量檢測采用分光光度法[14]。原理為褐藻酸與2價以上金屬離子生成的褐藻酸鹽類(鎂鹽除外)是水不溶性的。利用褐藻酸鈉與硫酸銅進行反應, 生成褐藻酸銅[Cu(Alg)2], 過量的銅離子在pH為8.5的堿性條件下與二乙基二硫代氨基甲酸鈉(銅試劑)作用產生黃棕色配合物, 在其最大吸收波長447 nm條件下測定該配合物的吸光值, 利用標準曲線求出與褐藻酸鈉結合的銅離子量進而計算褐藻酸的含量。

1.5 褐藻寡糖的TLC檢測

褐藻寡糖的分析檢測可以用薄層層析法(TLC)對樣品進行初步定性分析[15]。采用 Silica Gel 60 F254 硅膠板, 上樣量為 2 μL, 展開劑體系為正丁醇∶甲酸∶水 = 4∶5∶1(∶∶), 將硅膠板置于層析缸中使層析液將其兩次展開, 每次展開后室溫下吹干, 用硫酸-乙醇溶液作為顯色劑, 再次吹干后, 在 110℃下顯色5 min, 結果照相保存。

1.6 褐藻寡糖的質譜鑒定

取36 h發酵液2 mL加入4倍體積的無水乙醇, 12 000 r/min離心15 min, 去除發酵液中大分子成分。離心后上清液凍干后進行質譜鑒定[16]。

1.7 種子萌發及生長實驗

挑選大小相近、顆粒飽滿的小麥種子, 分別用清水, 雷力2000 (北京雷力), 馬尾藻水提液, 馬尾藻36 h發酵液(含褐藻寡糖), 馬尾藻72 h發酵液(不含海藻寡糖)浸泡小麥種子, 每組處理分別稀釋200倍、400倍、600倍、800倍4個濃度, 清水處理和雷力海藻肥為對照組。

每組處理的種子均浸于相應濃度的溶液中 12 h, 浸種完畢后用蒸餾水沖洗 3 次。將種子整齊播在鋪有雙層濾紙的培養皿中, 每個培養皿中均放置 60 粒小麥種子, 每個處理3個平行共180粒種子, 用紗布蓋上, 置于25℃培養箱中培養, 期間及時添加清水保持濕潤, 培養48 h后測定小麥種子萌發率。

將大小相近顆粒飽滿的小麥種子用清水浸泡12 h, 播撒在發芽盒中, 置于25℃培養箱中培養48 h, 期間保持濕潤。待小麥種子發芽后, 挑選長勢相近的幼苗, 轉移至盛有上述不同液肥處理的三角瓶中, 進行水培實驗。每個三角瓶中移接3株小麥幼苗, 每組處理設3個平行共9株幼苗, 置于光照培養箱(浙江托普 GTOP-310B)中培養, 培養條件為25℃光照12 h, 16℃暗處理12 h。培養72 h后, 對小麥植株進行形態觀察并照相記錄, 選取5株幼苗, 用直尺測量小麥根長。上述實驗均進行3次重復。

1.8 數據處理

采用統計學分析軟件SPSS 19.0對不同處理的種子萌發率和根長數據進行標準差和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 4種菌株的鑒定結果

馬尾藻表面生長的菌落經稀釋涂布馬尾藻平板, 獲得4種形態不同的菌株(圖1), 其中菌株A1和M1為革蘭氏陽性菌, 菌株C1和S1為革蘭氏陰性菌。4種菌株經16SrDNA測序, 序列比對結果顯示, M1菌株與巨大芽孢桿菌()相似度最高為99.79%, A1菌株與賴氨酸芽孢桿菌()相似度最高為99.17%, S1菌株與鞘氨醇單胞菌()相似度最高為99.06%, C1菌株與非脫羧勒克菌()相似度最高為99.37%。采用鄰接法構建4株菌的系統發育樹, 結果顯示與上述4種菌親緣關系最近(圖2)。

2.2 混合菌株發酵馬尾藻特性

4種菌株等比例混合接種到馬尾藻水提液培養基中, 菌株生長曲線與在2216E培養基中相比有顯著區別。首先菌種生物量即最大OD600值為2.5(圖3A)明顯低于2216E培養基中的4.0(圖3B), 說明馬尾藻水提液培養基對發酵菌種來說較難利用, 不如2216E培養基中的營養成分轉化利用率高。其次, 馬尾藻水提液培養基在發酵36 h出現菌種二次生長現象, 與此同時發酵液pH值出現小幅度先降后升的變化波動; 而在2216E培養基中則無此變化。該結果說明以馬尾藻為營養物質的培養基在菌株發酵至一定階段后, 會出現某種代謝產物作為新的碳源為菌種二次生長提供營養。隨后檢測發酵液中的褐藻酸含量變化, 結果顯示發酵液中的褐藻酸含量在發酵前期基本保持穩定, 但在36 h顯著下降, 含量降至初始值的40%并保持穩定(圖3C)。由此推測菌株在發酵馬尾藻過程中會分泌褐藻酸裂解酶至胞外, 但該酶只偏好降解褐藻酸的其中一種組分(聚甘露糖醛酸或聚古羅糖醛酸), 故發酵結束后發酵液中仍有部分褐藻酸未被降解。為驗證此推論, 將36 h的發酵上清液與馬尾藻水提液培養基混合, 置于30℃培養, 結果顯示褐藻酸含量隨培養時間的延長呈逐漸下降的趨勢(圖3D), 反應7 h后褐藻酸含量降至初始值的40%左右, 與上述發酵結果一致; 而經煮沸15 min后的發酵液則無法降解褐藻酸。該結果表明發酵液中確實含有褐藻酸裂解酶。

A. 混合菌群在馬尾藻培養基中的生長曲線和pH變化曲線; B. 混合菌群在2216E培養基中的生長曲線和pH變化曲線; C. 馬尾藻培養基褐藻酸含量變化; D.發酵液中褐藻酸裂解酶酶活檢測。SFE為海藻發酵液; SWE為海藻水提液

A. The growth and pH curves of mixed strain in seaweed water extract media; B. The growth and pH curves of mixed strain in 2216E media; C. Change of alginate content in seaweed water extract media; D. Detection of alginate lyase activity of fermentation broth

SFE stands for seaweed fermentation extract; SWE stands for seaweed water extract

2.3 馬尾藻發酵液中褐藻寡糖的檢測

褐藻寡糖是褐藻酸降解后產生的低聚合度的糖鏈片段, 同時也是發酵液中含褐藻酸裂解酶的有力證明。因此, 我們通過薄層層析(TLC)對馬尾藻發酵液進行褐藻寡糖的檢測, 從而進一步驗證發酵液中是否存在褐藻酸裂解酶。TLC結果顯示, 36 h發酵液中含有褐藻寡糖, 聚合度在2~8之間(圖4A); 隨后根據此次點樣結果, 調整取樣時間(自24 h至48 h, 每4 h取一次樣), 結果表明在28~40 h這一時段均能檢測的褐藻寡糖, 但褐藻寡糖含量及種類隨發酵時間的延長呈遞減趨勢, 發酵40 h后便檢測不到褐藻寡糖(圖4B)。褐藻寡糖出現的時間段與褐藻酸含量突然下降、微生物二次生長的時間段一致。由此我們推測, 在發酵36 h褐藻酸降解成為褐藻寡糖, 而褐藻寡糖作為碳源被菌株利用并出現二次生長現象。該結果顯示發酵32~36 h為褐藻寡糖的最佳收獲時間。隨后, 36 h的發酵液經質譜鑒定, 結果顯示此發酵液中富含聚合度2~5的褐藻寡糖(圖4C)。

A. 不同時間發酵液中褐藻寡糖的薄層層析圖譜; B. 取樣時間縮短后發酵液中褐藻寡糖的薄層層析圖譜; C. 36 h發酵液中褐藻寡糖質譜結果。Control為寡糖標準品; DP2為寡聚二糖; DP8為寡聚八糖

A. The TLC profile of alginate oligosaccharides in fermentation broth with different fermentation time; B. The TLC profile of alginate oligosaccharides in fermentation broth with sampling intervals narrowed; C. The MS result of alginate oligosaccharides in 36 h fermentation broth. Control stands for standard alginate oligosaccharides; DP2 stands for degree of polymerization of 2; DP8 stands for degree of polymerization of 8

2.4 馬尾藻發酵液的促生長效果

上述TLC及ESI-MS結果顯示, 馬尾藻36 h發酵液中含有褐藻寡糖。根據文獻報道褐藻寡糖對植物有促生長及誘導抗性等有益功效[17-23]。隨后, 設計對照及實驗組, 驗證褐藻寡糖的促生長功能。結果如圖5和表1、2所示, 與清水對照相比, 各濃度馬尾藻發酵液的促生長效果明顯, 小麥萌發率顯著提高, 根系長度明顯增加, 并且稀釋倍數越大, 其促生長效果越明顯。而海藻水提液的功效與發酵液相反, 稀釋倍數越大, 其促生長效應減弱, 并且水提液的促生長效應大多遜于同濃度下的發酵液。在所有對照組和實驗組中, 含褐藻寡糖的發酵液稀釋600和800倍的處理對小麥的促生長效果最為顯著。

表1 不同發酵液處理下的小麥種子萌發率

注: 不同字母表示處理間差異達到5%顯著水平. 下同

表2 不同發酵液處理下小麥根長

3 討論與結論

微生物發酵是利用微生物的代謝過程將底物轉化成為所需的產品。因此, 微生物是發酵過程的主導者, 選用合適的發酵微生物是獲取目的產物的關鍵。Uchida課題組發現實驗室冰箱中存放的石莼被微生物發酵釋放出酯類的氣味, 經分離純化他們得到了具有較強發酵能力的一株乳酸菌和酵母菌群, 并利用該微生物對海藻乳酸型和乙醇型發酵進行初步探索[24]。Shobharani等則是通過目的篩選的方法, 以馬尾藻提取物為唯一碳源的培養基篩選得到了能夠發酵馬尾藻的海洋來源的乳酸菌, 用來發酵馬尾藻獲取具有抗氧化功能的活性物質[25]。上述研究都是以海藻自身為菌種來源, 篩選分離能夠為己所用的“專用”菌種。這是符合自然界物種互相作用影響、共同進化規律的。因此, 海藻原位生長的菌種理論上可滿足各種海藻發酵需求。本研究從降解褐藻細胞壁成分的需求出發, 針對性的篩選馬尾藻原位生長的能夠破壞細胞壁結構的菌群。發酵結果證明該菌群在馬尾藻發酵過程中產生褐藻酸裂解酶, 能夠降解褐藻細胞壁組成成分褐藻酸, 有利于破壞海藻細胞壁結構促使胞內活性物質釋放, 而單一菌種發酵馬尾藻在72 h內均無法降解褐藻酸(數據未顯示)。這一結果表明, 混合菌群在降解褐藻酸方面比單一菌種更有優勢, 或許存在協作共生關系, 其具體作用機制有待進一步的深入研究。

同時, 褐藻酸降解產物褐藻寡糖也是一種功能成分, 能夠誘導植物產生多種反應。近年來, 褐藻寡糖的功能成為研究熱點, 結果表明褐藻寡糖有明顯的促生長功能及免疫誘抗功能[26, 27]。本研究在馬尾藻發酵液中檢測到褐藻寡糖成分, 這是首次報道以海藻提取液為發酵底物獲得褐藻寡糖。褐藻寡糖成分可被微生物作為碳源利用, 因此需要控制發酵過程及時間, 最大限度的收獲褐藻寡糖。多次發酵實驗結果表明, 通過控制發酵菌株的接種比例(4菌株等比例混合), 發酵32~36 h可獲得穩定的發酵產物, 即聚合度為2-5的褐藻寡糖, 并且褐藻寡糖生成伴隨明顯的pH波動, 菌體二次生長等現象。將來在海藻工業化生產中, 通過監測發酵過程pH變化即可反映發酵產物的生成狀況。

海藻發酵液的促生長功能通過小麥種子萌發及根長實驗得到了初步驗證。結果表明馬尾藻發酵液的要比未發酵的水提液促生長效果明顯, 而含褐藻寡糖的發酵液要比不含褐藻寡糖的發酵液效果好, 這說明微生物發酵過程確實將海藻肥中的營養成分“升級換代, ”更有利于植物吸收利用。同時, 該結果再次證明褐藻寡糖的促進植物生長功效顯著, 是海藻發酵液中至關重要的功能成分。另外, 馬尾藻發酵液對根的促生長效果存在濃度劑量效應, 結果顯示馬尾藻發酵液稀釋至600~800倍對小麥促根生長效果最為顯著, 與Anisimov等[28]的研究結果相符。本次使用的陽性對照為商品化的雷力海藻肥, 但其促生長效果不太理想, 可能是因為雷力海藻肥為高度濃縮產品, 若稀釋倍數太低, 其促生長效應大打折扣甚至會抑制作物生長。

本研究通過原位篩選馬尾藻附生菌群, 獲得了4株發酵馬尾藻的菌株, 控制4菌株接種比例可以獲得穩定的發酵產物, 發酵36 h生成聚合度2-5的褐藻寡糖, 并伴隨菌株二次生長及pH下降等易于觀察監測的參數變化, 這對海藻發酵工業化生產具有指導意義。發酵原液稀釋600倍后, 能夠明顯促進小麥種子萌發及根生長, 萌發率提高26%, 根系長度增長37%, 具有商業化產品開發潛力和價值。

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Studies on fermentation ofby mixed microorganism utilized as seaweed fertilizer

WANG Ming-peng1, CHEN Lei2, LIU Zheng-yi2, WANG Xue-jiang4, QIN Song2, YAN Pei-sheng1, 3

(1. School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China; 2. Yantai Institute of Costal Zone Research Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 3. School of Marine Science and Technology, Harbin Institute of Technology, Weihai 264209, China; 4. Worldfull Agricultural Science and Technology Co., Ltd, Yantai 264000, China)

Fermentative microorganisms present on the surface of seaweed were screened and then identified by 16S rDNA sequence analysis. We obtained the following four fermentative strains:,,, and. Using controlled inoculation proportion of these four strains, we obtained a stable fermentation product. We studiedthe changes and mechanisms of seaweed fermentation processto provide theoretical and data support for industrialization production of seaweed fermentation fertilizer. At 36 h in the fermentation process, alginate oligosaccharides with polymerization degrees of 2–5 were generated and accompanied by secondary growth of fermentative strains and a decreased pH, which were the parameters that could be easily observed and monitored. Fermentation broth diluted 600 times could significantly promote the germination and root growth of wheat seeds. Germination rate was 26% higher and root growth was 37% longer than those in the control group, respectively. These results provided a feasible strategy for the production of seaweed fertilizer by microbial fermentation. This simple and effective fermentation method has strong operability and broad application prospects.

fermentation;; alginate oligosaccharide; growth promotion

Q815

A

1000-3096(2017)02-0117-08

10.11759/hykx20160428001

2016-04-28;

2016-07-26

威海市科技發展研究計劃重點項目(2010-3-96); 國家“十二五”科技支撐計劃項目(2013BAB01B0); 中國科學院科技服務網絡計劃項目(KFJ-EW-STS-060); 國家自然科學基金青年基金項目(41401285); 河口與海岸學國家重點實驗室開放課題項目(SKLEC-KF201412); 海洋公益性行業科研項目(201505022)

王明鵬(1988-), 男, 山東聊城人, 博士研究生, 從事海洋生物資源利用研究, 電話: 0535-6929515, E-mail: wmpdsg@ 126.com; 閆培生, 通信作者, E-mail: yps6@163.com; 秦松, 通信作者, E-mail: sqin@yic.ac.cn

Apr. 28, 2016

[Science and Technology Development Project of Weihai (2010-3-96), National Key Technology R&D Program of China (2013BAB01B0), Science and Technology Service Network Initiative of Chinese Academy of Sciences (KFJ-EW-STS-060), Young Scientists Fund of National Natural Science Foundation of China (41401285), Open Foundation of State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research (SKLEC-KF201412), PublicScience and Technology Research Funds Projects of Ocean (201505022)]

(本文編輯: 康亦兼)