壯藥癌痛消膠囊干預(yù)肝癌(H22)荷瘤小鼠的實驗研究△

黃 鑫 黎 麗 何俊煒

(廣西民族醫(yī)藥研究院，廣西 西寧 530001)

實驗研究

壯藥癌痛消膠囊干預(yù)肝癌(H22)荷瘤小鼠的實驗研究△

黃 鑫 黎 麗 何俊煒

(廣西民族醫(yī)藥研究院，廣西 西寧 530001)

目的：研究癌痛消膠囊對肝癌(H22)荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用。方法:60只昆明(KM)小鼠進行H22實體瘤造模后隨機分6組。連續(xù)給藥干預(yù)12d后觀察并記錄H22荷瘤小鼠日?；顒拥挠绊?，測定小鼠抑瘤率及計算脾臟、胸腺、肝臟重要臟器指數(shù)；檢測小鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)水平；檢測H22荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖功能。結(jié)果:癌痛消膠囊高、中、低劑量組和環(huán)磷酰胺給藥組的抑瘤率分別為48%、32.7%、20.4%和41.8%，均具有明顯的抑瘤作用(P<0.05)。給予癌痛消膠囊后小鼠血清中TNF-α、IFN-γ水平均顯著增高(P<0.05)。癌痛消膠囊可顯著促進H22荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖。結(jié)論:癌痛消膠囊對肝癌(H22)荷瘤有明顯的抑制作用，能顯著提高免疫力。

癌痛消膠囊；肝癌(H22)；抗腫瘤；壯藥

壯族醫(yī)藥作為中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的瑰寶，以其博大精深的理論體系及獨特的臨床有效性而被認(rèn)同。在腫瘤、中風(fēng)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等復(fù)雜性疾病的治療中具有獨到的認(rèn)識及有效的治療效果，其中壯藥癌痛消膠囊(壯文名稱：消癌尹Siungamxin )治療腫瘤在壯醫(yī)醫(yī)學(xué)及臨床組方中被證明是行之有效的。壯藥癌痛消膠囊是由珍珠貝肉提取物及半枝蓮組成的復(fù)方藥[1]。以往研究及方劑的臨床表明，壯藥癌痛消膠囊用于肺癌(非小細(xì)胞癌)、肝癌的治療；亦可用于癌癥疼痛輔助治療，同時強化人體免疫機能。肝癌是最常見惡性腫瘤，患病率在我國惡性腫瘤居第1位。本實驗試圖建立肝癌(H22)荷瘤小鼠腫瘤模型，分別計算各實驗組小鼠H22瘤塊的抑瘤率及計算脾臟、胸腺、肝臟重要臟器指數(shù)變化，測定小鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)指標(biāo)水平; 并檢測H22荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖功能，旨在研究癌痛消膠囊對 H22 荷瘤小鼠抗腫瘤作用，為壯藥癌痛消膠囊臨床治療肝癌提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及瘤株： 將60只平均體質(zhì)量為(20±2)g的健康昆明種小鼠作為造模對象，雌雄各30只，8周齡[廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心供應(yīng)，許可證號:SCXK桂2014-0002]; 小鼠肝癌(H22)瘤株由武漢大學(xué)細(xì)胞庫提供。

1.2 藥物與試劑： 壯藥癌痛消膠囊( 廣西壯醫(yī)醫(yī)院，批號150611)，環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號 14112327)，小鼠TNF-a ELISA 試劑盒(Boster Biological Technology，批號240801041255)，小鼠IFN-γELISA 試劑盒( Boster Biological Technology，批號9810111161221)。

1.3 主要儀器： 酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司，型號 MK3)，洗板機(Thermo公司，型號AC9)，高速離心機(湘儀離心機廠，型號TG17W) ，顯微鏡(日本，Olympus 公司)。

1.4 分組與造模： 將60只昆明種小鼠隨機分為6組:癌痛消膠囊高劑量組、癌痛消膠囊中劑量組、癌痛消膠囊低劑量組、環(huán)磷酰胺給藥組、H22腫瘤模型組和正常對照組，每組10只，雌性5只，雄性5只。

H22肝癌移植瘤小鼠模型的建立：常規(guī)方法復(fù)蘇H22小鼠肝癌細(xì)胞，取0.2mL細(xì)胞懸液注射到雄性昆明小鼠腹腔內(nèi)，連續(xù)傳兩代。無菌操作取第2代腹水，用無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL，用1mL的注射器在每只小鼠左前肢腋窩皮下接種0.2 mL，操作過程全部在無菌條件下進行，30 min內(nèi)完畢。觀察小鼠接種部位的腫瘤生長情況7d，接種部位可觸及結(jié)節(jié)為接種成功[1]。

1.5 實驗給藥方法： 除正常對照組之外，5組小鼠均進行肝癌(H22)荷瘤移植造模。24h后，稱重并根據(jù)個體重量進行藥物干預(yù):正常對照組不給予任何干預(yù)措施，每日給予生理鹽水0.2mL/10g灌胃，干預(yù)治療第給予生理鹽水0.2mL/10g腹腔注射;環(huán)磷酰胺給藥組給環(huán)磷酰胺80mg.kg-1，干預(yù)治療腹腔注射環(huán)磷酰胺，給予生理鹽水0.2mL/10g灌胃; H22腫瘤模型組每日給予生理鹽水0.2mL/10g灌胃，干預(yù)治療給予生理鹽水0.2mL/10g腹腔注射;打開膠囊后，溶于生理鹽水經(jīng)人與實驗動物間給藥劑量換算公式，配成高劑量組(10g.kg-1)、中劑量組(6g.kg-1)、低劑量組(3g.kg-1)每日1次灌胃給藥，給藥治療第1天給予生理鹽水0.2mL/10g腹腔注射。給藥持續(xù)12d，

1.6 實驗觀察指標(biāo)

1.6.1 一般情況： 每天稱體重，觀察小鼠的死亡及自主活動、攝食、飲水、毛發(fā)、糞便、尿液及眼、耳、鼻、口有無分泌物。

1.6.2 H22荷瘤小鼠模型的抑瘤率： 造模后連續(xù)灌胃治療12d后處死昆明種小鼠，經(jīng)解剖取出H22瘤塊并迅速擇取胸腺、脾臟、肝臟稱重，計算抑瘤率及各重要要臟器指數(shù)。抑瘤率=(腫瘤模型組小鼠瘤塊的平均重量-癌痛消膠囊不同劑量給藥組小鼠瘤塊的平均重量)/腫瘤模型組小鼠瘤塊平均重量×100%；器官指數(shù)=器官重量(mg)/小鼠體重(g)[3]。

大明路功能定位為南北方向的主干路，永樂路為支路，路口東北象限是正在建設(shè)的醫(yī)療中心一期，東南象限是規(guī)劃預(yù)留的醫(yī)療中心二期，西南和西北象限是兩個現(xiàn)狀的老小區(qū)。其中醫(yī)療中心的三個出入口的作用為：大明路門口為大門，同時是急救車流入口；永樂路門口為門診入口，東風(fēng)河路門口為醫(yī)療中心后門。見圖2。

1.6.3 檢測各組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ水平： 各組小鼠連續(xù)給藥12 d，末次給藥第2d，將小鼠斷頭取全血裝入離心管，在室溫下穩(wěn)定放置30min，3000r/min離心10min，小心吸取血清，按照相應(yīng)的試劑盒按說明書方法檢測小鼠血清中TNF-α、IFN-γ水平。

1.6.4 癌痛消膠囊對H22荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 ：采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法[4]檢測各實驗組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖狀況。將小鼠脾臟研碎制成1×107個/mL細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中100μL/孔，并同時加入RPMI-1640培養(yǎng)液100μL，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)12、24和48 h,每孔加MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)并吸取掉上清液后加入二甲基亞砜(DMSO) 150μL/孔，均勻振蕩10min，使結(jié)晶物盡快量融解。酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀在490nm波長下測定各孔光吸收值并記錄結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法：計量數(shù)據(jù)采用(±s)表示,采用數(shù)據(jù)處理軟件SPSS19.0進行數(shù)據(jù)處理,并進行單因素方差分析,當(dāng)結(jié)果為P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況： 在接種肝癌瘤株后7d，約85%小鼠右前腋下可觸及黃豆大小瘤塊。分組前荷瘤小鼠，動作敏捷，反應(yīng)靈活，皮毛光滑，進食、進水與空白組無差異；隨著實驗的進展，H22腫瘤模型組小鼠精神萎靡,運動量減少,瘤塊腫大,毛色灰暗、不清潔;環(huán)磷酰胺給藥組小鼠的精神狀態(tài)良好,活動基本正常,皮毛基本光潔,優(yōu)于H22腫瘤模型組,腫瘤生長潛伏期為4d,腫瘤生長速度最慢; 癌痛消膠囊低劑量組小鼠精神狀態(tài)一般,活動基本正常,皮毛基本光潔,優(yōu)于H22腫瘤模型組,腫瘤生長潛伏期為3d,腫瘤生長速度慢于H22腫瘤模型組;癌痛消膠囊中劑量組小鼠精神狀態(tài)良好,活動基本正常,皮毛基本光潔,優(yōu)于癌痛消膠囊劑量組,腫瘤生長潛伏期為3d,腫瘤生長速度慢于癌痛消膠囊低劑量組; 癌痛消膠囊高劑量組小鼠精神狀態(tài)良好,活動情況基本正常,皮毛基本光潔,優(yōu)于癌痛消膠囊低劑量組,腫瘤生長潛伏期4d。

2.2 癌痛消膠囊對H22荷瘤小鼠抑瘤率及重要臟器指數(shù)的影響： 與正常對照組相比，H22腫瘤模型組的胸腺、脾臟指數(shù)均減少明顯(P<0.05)；環(huán)磷酰胺給藥組的胸腺、脾臟指數(shù)減少不明顯但肝臟指數(shù)減少明顯;癌痛消膠囊高劑量組的胸腺、脾臟及肝臟指數(shù)均減少不明顯;癌痛消膠囊中劑量組的胸腺、脾臟及肝臟指數(shù)均減少(P<0.05);癌痛消膠囊低劑量組的胸腺、脾臟及肝臟指數(shù)均明顯減少(P<0.05)。

與H22腫瘤模型組相比,環(huán)磷酰胺給藥組及癌痛消膠囊高劑量組的胸腺、脾臟指數(shù)均明顯提升(P<0.05);癌痛消膠囊中劑量組的胸腺及脾臟指數(shù)有增高(P<0.05),而肝臟指數(shù)均變化不明顯;癌痛消膠囊低劑量組的臟器指數(shù)變化不明顯。

表1 癌痛消膠囊對H22荷瘤增長抑制作用及臟器指數(shù)的影響±s,n=10)

注：與正常對照組比較，＊P<0.05 ；與模型組比較，▲P<0.05；與環(huán)磷酰胺組比較△P<0.05 。

2.3 癌痛消膠囊對H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IFN-γ水平的影響 :與正常對照組比較，H22腫瘤模型組小鼠血清中IFN-γ、TNF-α水平均下降(P<0.05); 環(huán)磷酰胺給藥組血清中TNF-α水平顯著下降(P<0.05)；癌痛消膠囊中、高劑量組IFN-γ、TNF-α水平均顯著升高。

與H22腫瘤模型組比較，癌痛消膠囊不同劑量給藥組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ水平均上升(P<0.05)，其中癌痛消膠囊中劑量組水平最高，環(huán)磷酰胺給藥組血清中只有IFN-γ水平升高(P<0.05)。

與環(huán)磷酰胺給藥組比較，癌痛消膠囊中、高給藥組小鼠血清中TNF-α和IFN-γ水平均明顯升高(P<0.05)，其中癌痛消膠囊中劑量組的升高水平最高，見表 2。

表2 癌痛消膠囊對H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IFN-γ水平的影響

注：與正常對照組比較，＊P<0.05 ；與模型組比較，▲P<0.05；與環(huán)磷酰胺組比較△P<0.05 。

2.4 癌痛消膠囊對H22荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響:12h時,與正常對照組比較，H22腫瘤模型組、環(huán)磷酰胺給藥組和癌痛消膠囊低劑量組T淋巴細(xì)胞增殖能力下降(P<0.05)。與H22腫瘤模型組相比，癌痛消膠囊中、高劑量組T淋巴細(xì)胞增殖能力明顯提升(P<0.05)。與環(huán)磷酰胺給藥組比較，癌痛消膠囊中、高劑量組T 淋巴細(xì)胞增殖能力明顯提升(P<0.05)。

24 h時,與正常對照組比較，H22腫瘤模型組、環(huán)磷酰胺給藥組和癌痛消膠囊低劑量組T 淋巴細(xì)胞增殖能力均下降(P<0.05)。與腫瘤模型組比較,癌痛消膠囊中、高劑量組T淋巴細(xì)胞增殖能力提升(P<0.05)。與環(huán)磷酰胺給藥組相比,癌痛消膠囊不同劑量給藥組的T淋巴細(xì)胞增殖能力均明顯提升(P<0.05)。

48 h時,與正常對照組比較,癌痛消膠囊不同劑量給藥組小鼠脾臟的T淋巴細(xì)胞增殖能力均明顯提升(P<0.05)。與H22腫瘤模型組比較，癌痛消膠囊不同劑量給藥組的T淋巴細(xì)胞增殖能力均明顯提升(P<0.05)。與環(huán)磷酰胺給藥組比較,癌痛消膠囊不同劑量給藥組的T淋巴細(xì)胞增殖能力均顯著提升(P<0.05),見表 3。

表3 癌痛消膠囊對H22荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

注：與正常對照組比較，＊P<0.05 ；與模型組比較，▲P<0.05；與環(huán)磷酰胺組比較△P<0.05 。

3 討論

壯藥癌痛消膠囊是由珍珠貝肉經(jīng)過生物提取及冷凍干燥后與植物藥半枝蓮組成的復(fù)方制劑。其以往研究及方劑的臨床表明，對于肺癌(非小細(xì)胞癌)、肝癌的治療；亦可用于癌癥疼痛輔助治療，同時強化人體免疫能力。本實驗通過建立肝癌(H22)荷瘤小鼠模型，觀察癌痛消膠囊對小鼠的日?；顒蛹熬駹顟B(tài)的影響，測定藥物的抑瘤率、重要臟器指數(shù)、脾臟T淋巴細(xì)胞增殖功能，檢測血清中TNF-α、IFN-γ含量以了解腫瘤導(dǎo)致的小鼠精神狀態(tài)及各項指標(biāo)改變，并探討壯藥癌痛消膠囊抗腫瘤作用。

機體的細(xì)胞免疫、體液免疫能力正常時，腫瘤細(xì)胞不易產(chǎn)生和生長。但免疫力減退時，機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)被打破，腫瘤發(fā)生的幾率就大大增加。因此，如果能夠用食品或藥物增強免疫力，那么將對腫瘤的抑制與治療產(chǎn)生非常積極的效果[6]。本實驗結(jié)果顯示給予癌痛消膠囊干預(yù)治療后，不同劑量癌痛消膠囊給藥組小鼠的日常生活狀態(tài)有所改善，胸腺、脾臟指數(shù)增高，T淋巴細(xì)胞的增值能力明顯增強; 癌痛消膠囊高、中劑量給藥組小鼠的肝臟指數(shù)也增高。胸腺、脾臟分別是機體重要的中樞、外周免疫器官。脾臟是淋巴細(xì)胞發(fā)育、定居、增殖的場所及產(chǎn)生特異性免疫的基地，而胸腺產(chǎn)生大量的胸腺細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的后備，這些免疫器官重量的增加可以在一定程度上反映機體的免疫能力。發(fā)揮細(xì)胞免疫功能的T淋巴細(xì)胞是在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟、脾臟內(nèi)定居并在免疫應(yīng)答中增殖，脾臟和胸腺指數(shù)的高低可反映T淋巴細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞數(shù)量的多少，可直接作為反映機體免疫功能狀態(tài)的參數(shù)之一; 胸腺和脾臟分別屬于中免疫器官和外周免疫器官，胸腺是T淋巴細(xì)胞成熟的場所，脾臟是成熟淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞定居的場所，胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)可直觀反映機體免疫功能的強弱。另外抑瘤率也驗證了癌痛消膠囊可以抑制肝癌H22腫瘤的生長，并且可提高機體免疫能力，提示癌痛消膠囊對腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制效應(yīng)，其抑瘤活性可能與其免疫增強作用有關(guān)。

TNF-α是一種由巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞活化產(chǎn)生的多效細(xì)胞因子，其具很強的惡性腫瘤殺傷功能，而不損傷正常細(xì)胞[7]。TNF-α可刺激機體激活T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和抗體，并對惡性腫瘤細(xì)胞有一定的殺傷作用，也可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。IFN-γ又別名為Ⅱ型干擾素，其是由活化的T細(xì)胞與NK細(xì)胞生成，IFN-γ可使巨噬細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類分子的表達(dá)增加，增強 MHC抗原遞呈能力[7]; 同時還能使巨噬細(xì)胞表面 Fc受體的表達(dá)增強，促進其吞噬免疫復(fù)合物及抗體包被的腫瘤細(xì)胞和病原體。此外，IFN-γ還能增強Th1細(xì)胞的細(xì)胞免疫功能，增強中性粒細(xì)胞吞噬能力，增強NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。TNF-α是一種由巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞活化產(chǎn)生的多效細(xì)胞因子，其具很強的惡性腫瘤殺傷功能，而不損傷正常細(xì)胞[7]。本實驗結(jié)果顯示，癌痛消膠囊可顯著提升小鼠血清中TNF-α及INF-γ的含量，表明癌痛消膠囊可以改善荷瘤機體細(xì)胞因子水平，使TNF-α和INF-γ處于較高水平，從而發(fā)揮抗腫瘤及調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用。本研究發(fā)現(xiàn)癌痛消膠囊可通過調(diào)控細(xì)胞因子進而改善機體免疫力，實現(xiàn)對惡性腫瘤的抑制作用，體現(xiàn)在H22荷瘤小鼠瘤塊的重量減少、主要免疫器官胸腺及脾臟重量增加及T淋巴細(xì)胞增殖方面，為痛消膠囊進一步臨床應(yīng)用提供了研究依據(jù)。

[1]黃漢儒.中國壯醫(yī)學(xué)[M].南寧:廣西民族出版社.2000:10.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S]. 2005版. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:151.

[3]艾金霞，崔煥波.SBHL對S180荷瘤小鼠腫瘤生長及免疫功能的影響[J]．中國實驗診斷學(xué)，2010;14(6):828-30.

[4]Chenevix-Trench G，Healey S，Lakhani S，et al． Genetic and his-topathologic evaluation of BRCA1 and BRCA2 DNA sequence vari-ants of an known clinical significanceJ]． Cancer Res，2006，66(4) :2019-2027．

[5]黃小燕，黃 莎，陳慶富.金蕎麥葉發(fā)酵茶抗小鼠H22 腫瘤的作用及機制研究[J]．安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015;42(6):854-859.

[6]肖順漢，劉明華，鐘 琳等.克癌新對荷瘤小鼠IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α水平的影響[J].中藥藥理與臨床，2008; 24(2): 82-4.

[7]劉曉,溫瑞興.中藥抗腫瘤作用的研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2011,11(24):4978-4980.

[8]李俊，傅恩賜，許愛華，等. GBEE對荷瘤小鼠IL-2、IL-12、TNF-α及TGF-α水平的影響[J]．中國免疫學(xué)雜志，2012; 28( 5) : 415-417.

[9]賀牡丹，王小平，陳同生 .白介素-1β誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的分子機理[J]．中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2011;33(1):49-54.

[10]周宜強，李忠．中醫(yī)腫瘤學(xué)科發(fā)展報告[J]．中醫(yī)藥管理雜志，2008，16(1):73．

2016年10月8日收稿

Study of Zhuang medicine AiTongXiao Capsule effect on mice Hepatocellular carcinoma (H22) tumor

HUANG Xin1LI Li2HE Jun-wei2

Guangxi ethnic medicine institute, 1.pharmacological room 2.industry development center

Objective:To study AiTongXiao Capsule on hepatocellular carcinoma (H22) inhibition of tumor in mice. Methods :60 Kunming (KM) mice were randomLy divided into 6 groups after the model was made of H22 solid tumor. Continuous to interfere with drug after 12 days of observation and record the effects of the daily activities of the H22 Tumor bearing mice and mice was measured by rate of tumor and spleen, thymus, liver is an important organ of the index calculation; to detect the serum TNF-αand IFN-γgamma levels; detection of H22 Tumor Bearing Mice spleen T lymphocytes proliferation. Results: AiTongXiao capsule of high, medium and low dose group and cyclophosphamide for treatment group tumor inhibition rate were 48%, 32.7%, 20.4% and41.8% and has obvious anti tumor effect (P<0.05). Give AiTongXiao capsule after TNF-αin mice serum alpha, gamma IFN-γlevels were significantly increased (P<0.05). AiTongXiao capsule can significantly promote spleen T lymphocyte proliferation in H22 mice. Conclusion: AiTongXiao capsule has obvious inhibitory effect on H22 tumor, can significantly improve the immunity.

AiTongXiao capsule; hepatocellular carcinoma (H22); anti tumor; Zhuang Medicine

△廣西自然科學(xué)基本項目：項目任務(wù)書編號：2016GXNSFBA380009

黃鑫(1982-)，男,漢族，廣西橫縣人，廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院助理研究員，碩士學(xué)位，主要從事中藥，民族藥藥理研究工作。

R291.8

A

1006-6810(2017)02-0054-04