臨床鼻-鼻竇表皮葡萄球菌菌株體外細菌生物膜培養觀察

謝慧 俞菲 李玲瓏 竇豆 文東萍 曹劉

·實驗研究·

臨床鼻-鼻竇表皮葡萄球菌菌株體外細菌生物膜培養觀察

謝慧 俞菲 李玲瓏 竇豆 文東萍 曹劉

目的 統計優勢菌種為表皮葡萄球菌的例數分別在慢性鼻-鼻竇炎(CRS)患者、健康人中所占比率，對比兩組表皮葡萄球菌體外培養后細菌生物膜產膜率以及產膜強弱。方法 分組采集在臨床確診為慢性鼻-鼻竇炎患者、健康人中鼻道分泌物，對分泌物送檢進行優勢菌種鑒定，將優勢菌種為表皮葡萄球菌的菌株分別進行分離、保種；通過剛果紅平板法篩選生物膜陽性菌株和結晶紫染色法半定量檢測生物膜產膜強弱程度。結果 共收集39例中鼻道分泌物，其中CRS 20例，健康人19例；剛果紅平板法生物膜陽性菌株有11株，其中CRS 9株，健康人2株；結晶紫染色法半定量所得結果與剛果紅所測結果相同。結論 表皮葡萄球菌在CRS需氧菌種中所占比率最大，CRS患者表皮葡萄球菌菌株體外培養成膜率明顯高于健康人,CRS患者表皮葡萄球菌臨床菌株體外培養生物膜產膜能力強于健康人。

表皮葡萄球菌; 體外培養; 細菌生物膜; 慢性鼻-鼻竇炎

慢性鼻-鼻竇炎(CRS)是耳鼻喉科最常見慢性疾病之一，2012年美國成人健康數據統計報告:全國健康訪問調查顯示在過去一年中回顧性訪問調查中顯示患有鼻竇炎的成年患者約占12%[1]。本病的發病機制尚未完全明確，一般觀點認為細菌感染被認為是其中重要的因素之一。CRS的診斷要點之一是病程超過3月，而近些年發現細菌生物膜形態下細菌的耐抗生素能力是普通細菌的10到100倍，并逐漸認識到細菌生物膜成為一些疾病遷延成為慢性疾病的主導因素[3-6]。葡萄球菌是造成高發病率院內感染的主要原因之一，而表皮葡萄球菌菌株引起院內抗生素耐藥感染[1-2]表皮葡萄球菌在CRS患者鼻腔分泌物細菌分離鑒定中占13.2%～50.2%，比例均是最高[7-8]。但對于表皮葡萄球菌在CRS患者中細菌生物膜表達的研究還相對較少，因此本研究將觀察各類樣本中優勢菌種及鼻腔臨床分離株的表皮葡萄球菌產膜率。

1 材料與方法

1.1 材料

治療組：選取成都中醫藥大學附屬醫院門診經確證為CRS的患者20例。對照組：成都中醫藥大學及附屬醫院的健康者19例。以無菌棉簽在內窺鏡引導下在CRS患者中鼻道處旋轉棉簽3周左右沾取分泌物放入裝有無菌轉運液的EP管中。(采樣時間：2015年12月1日至2016年11月30日)

1.1.2 菌株

試驗菌株：鼻-鼻竇表皮葡萄球菌臨床分離株，由成都中醫藥大學附屬醫院檢驗科微生物室按照常規方法進行需氧菌培養、分離，通過法國生物梅里埃全自動微生物鑒定系統(型號VITEK?compact)鑒定優勢菌并保種，-20℃冰箱保存待用。質控菌株：表皮葡萄球菌生物膜表達陰性株ATCC12228(青島普華科儀商貿有限公司)。

1.2 主要試劑及設備

主要試劑：剛果紅(Congo Red)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)、結晶紫、碘化丙啶(PI)溶液。設備：各規格移液器：德國Eppendorf公司、隔水式電熱恒溫培養箱:上海躍進醫用光學器械廠、電子秤：日本SHIMADZU公司、酶標儀：美國Thermo公司、超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司、96孔聚苯乙烯微量培養板：美國COSTAR?公司、細菌濁度儀：北京天安聯合科技有限公司、激光共聚焦熒光顯微鏡：尼康映像儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 表皮葡萄球菌產膜能力定性試驗[9]

施工組織設計是招標人考核投標人施工技術水平和管理能力的依據，也是投標人合理報價和中標后組織施工管理的基礎。當前，招標人越來越重視施工組織設計的評審，以選擇報價合理、技術水平高、施工方法先進的施工隊伍。因此，投標企業要根據招標文件的要求及現場特點，結合企業自身的技術水平、管理水平、施工經驗、技術裝備等實際情況，認真優化施工組織設計，尤其施工方案的優化比選，如土方開挖是采用人工開挖還是采用機械開挖，運輸工具采用機動翻斗車還是采用自卸汽車。企業應制定相應激勵制度，鼓勵技術人員不斷創新，優化施工方案和施工部署，通過技術創新、管理創新，降低成本。

(1)試驗菌株的復溫、復蘇及復壯：從-20℃冰箱中取出試驗菌株室溫復溫，在超凈工作臺中用接種環將其接種于TSA平板上，置37℃恒溫培養箱中24h后取出(復蘇)。再次用無菌接種環挑取一個菌落接種于另一個TSA平板，置恒溫培養箱中37℃孵育24h后取出(復壯)。(2)剛果紅平板定性PIA+菌株：從復壯后的平板上挑取一個菌落接種于剛果紅平板上，置37℃恒溫培養箱中孵育24h后取出，室溫放置72h后，肉眼觀察結果。若菌落黑色、干燥、聚集，并出現結晶為PIA+菌株；菌落紅色、光滑、無聚集則為PIA-菌株。(3)光鏡下檢驗表皮葡萄球菌：從復壯后的平板上挑取一個菌落至載玻片，經革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察。(4)標記PIA+菌株。(5)每組試驗獨立重復三次。

1.3.2 表皮葡萄球菌產膜能力定量試驗[9]

(1)將含有接種表皮葡萄球菌的TSB放入恒溫搖晃培養箱中37℃增菌18h，使用細菌濁度儀用TSB調整細菌濁度至0.5麥氏單位(McFarland MCF)。(2)取96孔聚苯乙烯微量培養板，每孔加入100μl培養液，接種10μl菌液，每種菌株做9個孔的重復。每板設ATCC12228為陰性對照，空白對照及培養基對照，均做9復孔。(3)將接種好的96孔板在37℃恒溫培養箱中培養24h(4)吸出后培養液，加入PBS緩沖液沖洗板孔3次。(5)加入甲醇固定15min，吸出培養孔中的甲醇，風干。(6)每孔加入結晶紫溶液，室溫下染色5min。(7)吸出結晶紫染色液，流水沖凈多余的染料。(8)培養板倒置除去殘余水，37℃烘箱中烘干。(9)加入冰乙酸溶液，在37°C培養箱中作用30min。(10)用酶標儀在590nm波長處分別測定其A值。(11)產膜能力結果判定：每株試驗菌的 A值為其A590平均值減去空白對照孔A590平均值。標準菌株的A值測量同上操作，以標準菌株A值加上3倍標準差為界定值Ac，待測菌株A值大于界定值Ac即可判斷為其具有產膜能力。具體標準如下：

①強生物被膜形成株(A>2Ac)；

②弱生物被膜形成株(Ac

③無生物被膜形成株(A≤Ac)。

1.3.3 激光共聚焦觀察體外培養細菌生物膜

取滅菌后帶蓋玻片的培養皿，分2組，加入15ml待試驗的表皮葡萄球菌PIA+株菌液0.5MCF，置37℃恒溫培養箱中分別培養0.5d、1d、3d、7d，每天更換一次菌液。第1組用于觀察不同時間段體外培養的表皮葡萄球菌生物膜形態結構的變化。

2 結果

2.1 分離需氧優勢菌種

臨床共收集實驗組20例鼻分泌物、19例鼻分泌物分別經分離培養后需氧優勢菌種，總結見下表：

細菌種類試驗組(共20例)對照組(共19例)表皮葡萄球菌108金黃色葡萄球菌4—金黃色葡萄球菌+表皮葡萄球菌—1嗜麥芽窄食單胞菌2—人葡萄球菌12耳葡萄球菌11類白喉棒狀桿菌22似腸膜明串珠菌—3沃氏葡萄球菌—1玫瑰色克庫菌—1

2.2 表皮葡萄球菌產膜能力定性試驗

2.2.1 觀察結果

試驗菌株：

18株表皮葡萄球菌臨床株接種于剛果紅平板，37℃恒溫孵育24h后，肉眼觀察可見大部分菌落呈鮮紅色、暗紅色、深酒紅色、部分呈暗褐色，少數單個菌落呈黑色，菌落表面光滑、濕潤。菌落形態與在TSA培養基上大小基本一致，菌落周圍培養基未見明顯褪色。室溫狀態下放置24h后可見鮮紅色菌落減少，深酒紅色居多，一部分菌落表現為中央黑色或暗褐色，邊緣鮮紅整齊，部分呈暗褐色甚至黑色。深色菌落表面相對淺色菌落干燥，邊緣不光滑，未見明顯結晶樣物。菌落聚集，周圍培養基明顯褪色。(附圖1)

附圖1

質控菌株ATCC12228接種于剛果紅平板，37℃恒溫孵育24h后，肉眼觀察可見菌落呈鮮紅色，菌落表面光滑、濕潤。菌落形態與在TSA培養基上大小基本一致，菌落周圍培養基無明顯褪色。室溫狀態下放置24h后見大部分菌落仍呈鮮紅色，一部分菌落表現為中央顏色變深，邊緣鮮紅整齊。菌落濕潤，邊緣光滑。菌落無聚集，周圍培養基無明顯褪色。(附圖2)

2.2.2 統計結果

18株表皮葡萄球菌臨床株中，具有產膜能力的有11株，其中試驗組9株，對照組2株。

表2.2 試驗組與對照組鼻-鼻竇表皮葡萄球菌PIA表達結果

附圖2

附圖3

2.3 表皮葡萄球菌產膜能力定量實驗

試驗組9株表皮葡萄球菌有產膜能力，其中強產膜株1株，弱產膜株8株。對照組有2株具有產膜能力，且為弱產膜株。

表3.1 表皮葡萄球菌產膜能力定量測定

3 討論

CRS患者中的菌群分布特點：本研究中CRS患者、健康者竇口鼻道復合體處分離最多的需氧菌是表皮葡萄球菌，所占菌群比例分別是50%、42.11%，由此可見表皮葡萄球菌為無論在CRS組中還是對照組中均為優勢菌種，與與文獻報道結果相符。[7,10-11]產膜率及產膜強弱：本試驗中PIA+菌株占表皮葡萄球菌總菌株的61.1%，在CRS患者和健康人中均有發現具有產膜能力的菌株，實驗組與對照組的成膜率分別為90%、25%，對CRS組、對照組進行產膜表達率進行四格表確切概率法檢驗χ2=7.901、P=0.005(P<0.01)，說明試驗組的產膜率明顯高于對照組。對CRS組、對照組成膜強弱進行秩和檢驗U=2.731、P=0.016(P<0.05)具有統計學意義，證明試驗組產膜強度大于對照組。在產膜能力結果判讀上，剛果紅定性試驗和結晶紫染色法試驗結果無明顯差異性。由此可見細菌生物膜在CRS患者中有一定存在比例，并據此結果可以推斷細菌生物膜是導致慢性鼻竇炎耐藥及遷延不愈的一個重要因素。

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The bactcriac biofilm observation of clinical nasal sinuses staphy lococcus epidermis strains in ritro culture

XIE Hui,YU Fei,LI Lin-long,DOU Dou,WEN Dong-ping,CAO Liu

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu,Sichuan,610075)

Objective Calculating the proportion of superiority strains for staphylococcus epidermis cases which are respectively in patients with chronic nasal sinusitis (CRS) ,and healthy people.compared the two groups after staphylococcus epidermis aureus in vitro bacterial biofilm production rate and production membrane strength.Comparing the two staphylococcus epidermis groups whose rate of bacterial biofilm production and the strength of biofilm after cultured in vitro.Methods Packeting nasal secretions of chronic nasal sinusitis patients and the healthy people.Identifying superiority strains in secretions.The advantages of strains for staphylococcus epidermis strains will be separated,storaged respectively；By Congo red plate filtering biofilm positive strains and by crystal violet staining semi-quantitative detecting biofilm production strength.Results There ere 39 cases of nasal secretions,among them including 20 CRS，19 healthy people; Congo red plate method measure biofilm positive strains 11 strains,including CRS9 strains,healthy people 2 strains；Compared with Congo red plate the results of crystal violet staining semi-quantitative are the same.Conclusion the staphylococcus epidermis account for aerobic bacteria the largest proportion in CRS.The proportion of CRS staphylococcus epidermis clinical strains cultured in vitro are obviously higher than healthy people.The ability of biofilm production of CRS patients staphylococcus epidermidis clinical strains which are clutured in vitro is stronger than heslthy people.

Staphylococcus epidermidis; Invitro culture; Biofilm; Chronic nasal sinusitis

基金來源：國家自然基金項目(項目編號：81403440)

610075,四川成都，成都中醫藥大學

謝慧,E-mail：wangxie-ctu@163.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.01.005

R765.4