洋蔥細胞質雄性不育系小孢子敗育的細胞形態學結構

程雨+宋策+陳典+王勇

摘要：為了探索洋蔥細胞質雄性不育系小孢子敗育的時間和形式，通過石蠟切片和電鏡技術對小孢子的發育進行觀察。結果表明，在花粉母細胞時期，不育系JA花藥室壁較保持系厚且有凹凸現象；在四分體時期，小孢子不飽滿呈月牙狀，絨氈層與藥室壁完全脫離，細胞質濃縮、空泡化；在小孢子發育時期，小孢子細胞質發生濃縮、降解、嚴重空泡化，絨氈層完全解體；在成熟花粉粒時期，小孢子完全干癟聚集在一起，花藥敗育。由此推測，洋蔥不育系JA小孢子發育異常始于花粉母細胞時期，在四分體時期呈現出敗育，敗育的原因在于絨氈層的提早解離。

關鍵詞：洋蔥；雄性不育；性狀轉育；四分體；小孢子；敗育；細胞形態學結構；絨氈層；解離

中圖分類號： S633.201文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0107-04

洋蔥（Allium cepa L.）為百合科蔥屬植物，別稱圓蔥、蔥頭，因其具有很好的食療保健作用和極高的藥用價值被譽為“菜中皇后”，在世界蔬菜生產面積上，排在馬鈴薯和番茄之后，位居第三[1]。我國是世界上洋蔥的第一大生產國和出口國，產地主要分布在內蒙古、甘肅、云南、山東、黑龍江等地[2]。洋蔥是最早育成并在生產上應用1代雜種的蔬菜作物之一[3]。洋蔥雜種優勢明顯，自交衰退嚴重，其1代雜種一般能增產20%～50%，其應用價值已被生產實踐所證實[4-5]。但洋蔥為2年生異花授粉作物，其花器小，花期不集中，單花結籽率低，人工去雄成本高、難度大，因此利用雄性不育系是配制雜交種子的有效途徑[6] 。研究洋蔥細胞質雄性不育的發生機理對于 F1雜種的生產具有重要的作用。目前，洋蔥細胞質雄性不育系主要分3類，即S型、T型和近年發現的瓣化型，其中S型在生產上應用廣泛[7-9]。前人對洋蔥CMS細胞學研究表明，洋蔥花藥敗育大都與絨氈層發育有關，花粉母細胞沒有異常表現。絨氈層的發育異常大致可歸納為3種形式：一是在四分體時期，絨氈層細胞提前解體，不能供給小孢子生長發育所需要的營養；二是在二分體時期，絨氈層過度肥大，而且會延遲解體，這2種類型中，絨氈層的解體總是發生在小孢子產生異常現象之前；三是絨氈層形態完全正常，只是存在時間過長[10-12]。一般研究認為，絨氈層細胞的異常死亡是造成小孢子敗育的主要原因；但也有研究表明，不育系與保持系絨氈層細胞變化不大。連高山等對某一洋蔥CMS研究發現，與可育系花粉母細胞相比，絨氈層細胞變化不大，但花粉母細胞次生壁和胼胝質合成受阻，細胞壁變薄，細胞內出現泡狀結構，有些泡狀體可相互融合，這種自噬現象的確與植物花藥敗育過程的細胞的敗育或者說程序化死亡有關[13]。不同的雄性不育材料間小孢子敗育發生的時期和原因并不完全一致，掌握敗育發生的時期和成因對于雄性不育的轉育和在生產上的應用意義重大。本試驗對洋蔥不育系JA及其保持系JB花粉發育過程進行觀察分析，從形態學和細胞學上對洋蔥細胞質雄性不育發生進行系統的跟蹤和比較，確定其不育發生的時期，推測不育發生的原因，從而為該不育系發生的生理學和分子生物學研究提供參考，進而為該雄性不育性狀的轉育和利用提供理論指導。

1材料與方法

1.1試驗材料

洋蔥雄性不育材料JA和保持系JB，由東北農業大學園藝學院蔥蒜課題組發現并選育。2013、2014年秋分別將JA和JB的種球種植于東北農業大學園藝站加溫溫室中，次年4月抽薹，開花后分別采集0.8～1.0、1.8～2.0、2.7～3.0、38～4.0 mm的花蕾，冰上剝離花藥備用（經預試驗確定其對應典型發育時期為花粉母細胞時期、二分體和四分體時期、單胞花粉粒時期、成熟花粉粒時期）。

1.2試驗方法

1.2.1不育株與可育株的形態特征在播種期到開花期分別標記植株編號，定期到溫室中觀察不育系與保持系的形態特征并拍照記錄。

1.2.2花藥顯微結構在開花盛期將采集的不同時期花藥樣本，放入FAA固定液中固定，石蠟切片法制片，切成厚 6 μm 的蠟帶，用梅氏黏貼劑粘在載玻片上，1%番紅染色，05%固綠復染，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并照相。

1.2.3花藥超微結構參考顯微結構觀察結果，將不同發育時期的花藥放入2.5%戊二醛進行前固定，用0.1 mol/L磷酸緩沖液進行漂洗，在1%四氧鋨酸固定液中固定2.5 h，再用0.1 mol/L磷酸緩沖液進行漂洗，經乙醇脫水后用1 ∶1比例的100%乙醇+100%丙酮脫水10 min，再用100%丙酮脫水10 min，固定及漂洗程序溫度均保持在4 ℃，浸透包埋后在超薄切片機上將其修成50～60 nm的小塊，用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，最后在H-7650透射電鏡下觀察并照相。

2結果與分析

2.1不育株與可育株的形態特征

從幼苗期到開花期，洋蔥不育株與可育株外形比較整齊一致，生長勢無規律性差異，花球大小也無明顯差異，但花蕾從表型上容易區分，即不育系JA花蕾雖然開放，但花絲逐漸縮小干枯，花藥干癟無花粉，多呈墨綠色后變褐色；保持系JB花蕾外形飽滿，花絲發育正常，花藥飽滿，呈黃色（圖1）。

2.2花藥的顯微結構

2.2.1花粉母細胞時期洋蔥雄蕾原基分化發育成4個藥室（圖2-A、圖2-B），每個藥室的造孢細胞分化成若干個花粉母細胞。保持系JB花粉壁發育形狀規則，由圖2-C可以看出，花藥壁由表皮、藥室內壁、中層、絨氈層組成，中層細胞核清晰可見，絨氈層細胞核染色深，核較大排列在花粉母細胞周圍。不育系JA花粉母細胞發育正常，但花粉囊細胞形狀不規則，藥室壁較保持系厚有凹凸現象，中層發育遲緩，花粉母細胞周圍被絨氈層細胞緊緊包圍（圖2-D）。

2.2.2四分體時期保持系JB花粉母細胞經過2次減數分裂形成四分體，也有未完成減數分裂的二分體存在，胞壁染色較淺，藥室表皮、內壁發育成熟，中層細胞排列整齊，細胞核清晰可見，絨氈層發育達到頂點，絨氈層細胞質濃郁發達，細胞核大、染色深（圖2-E）。不育系JA花粉母細胞正常發育成四分體，但幼嫩小孢子沒有保持系飽滿，似月牙狀（圖2-F），藥室表皮、內壁細胞膨大，比可育系厚，而中層細胞無發育跡象，細胞核染色較淺，絨氈層完全脫離藥室壁，緊緊圍繞四分體和二分體，胞質有明顯的濃縮現象并空泡化。

2.2.3游離小孢子時期保持系JB花藥中包圍四分體的胼胝質解體，釋放出小孢子，小孢子細胞核染色深清晰可見，絨氈層胞質降解，但其核染色仍較深，中層細胞沒有明顯變化，表皮和藥室內壁高度發達，藥室內壁出現纖維組織，細胞核染色較深（圖2-G）。不育系JA小孢子從表面看染色透明類似泡狀，中層細胞退化，絨氈層完全退化，看不到細胞核等結構，藥室內壁形成粗大的纖維組織（圖2-H）。

2.2.4成熟花粉粒時期保持系JB絨氈層在供應花粉發育所需要的營養后完全解離，整個花粉粒染色較深，形狀飽滿，花粉粒均勻地分散在藥室內，相鄰花粉囊相通，藥室內壁纖維化細胞出現雙核（圖2-I）。不育系JA空癟的花粉粒收縮擠在一起，粗大的纖維組織加厚，不具有開裂腔結構，藥室嚴重收縮變形，內壁幾乎貼在一起，纖維層不能形成裂口，花粉囊不相通（圖2-J）。

2.3花藥的超微結構

2.3.1四分體時期不育系JA絨氈層出現明顯胞質收縮、染色質濃縮、泡狀結構（圖3-A ）、內質網溢滿、線粒體膨脹（圖3-B），小孢子形狀不均勻，細胞質出現濃縮并有少量泡狀結構（圖3-C），所以從形態上推測不育系JA絨氈層細胞在四分體時期之前就開始了細胞編程性死亡（PCD）。保持系JB小孢子正常發育，核質濃郁，沒有濃縮現象（圖3-D）。

2.3.2游離小孢子時期洋蔥游離小孢子時期，保持系JB絨氈層釋放胞質內容物幫助形成小孢子壁，出現降解現象（圖3-E、圖3-F），不育系JA絨氈層退化嚴重，雖然有類似小孢子壁結構但小孢子緊密聚集在一起，細胞器無法辨別，出現大量泡狀結構，不能正常發育（圖3-G）。

2.3.3成熟花粉粒時期保持系JB隨著絨氈層細胞內容物的釋放，絨氈層形成線狀，但仍有殘留（圖3-H），花粉粒逐漸成熟，電子密度濃厚，染色很深（圖3-I）。不育系JA絨氈層無法辨別，花粉壁形成，但小孢子干癟、變形，內容物只剩殘留，完全敗育 （圖3-J）。

3討論與結論

前人研究表明，植物雄性不育小孢子敗育在不同植物材料中發生時期有所差異，相同材料不同品種間也存在差異[14-17]。本研究中不育系JA在花粉母細胞時期，小孢子花粉母細胞正常發育，藥室表皮和內壁細胞較保持系有加厚凹凸現象；在四分體時期出現敗育跡象，小孢子不飽滿呈月牙狀，超微觀察顯示小孢子出現細胞質濃縮現象，絨氈層過度肥大，出現液泡，藥室表皮和內壁細胞膨大；游離小孢子時期，小孢子細胞質濃縮加重，堆積在一起無法正常發育；成熟花粉粒時期，小孢子空癟，孢子囊皺在一起，中層和絨氈層完全退化，藥室變形不開裂。筆者分析比較發現，小孢子在四分體時期出現敗育跡象；但是李園園等研究發現，洋蔥細胞質雄性不育系63A四分體時期，四分體形成正常，而小孢子發育時期，小孢子細胞質發生濃縮、降解，絨氈層完全解體[12]，這與杜敏霞等的研究結果[18]相似。而王瑞麗等研究發現，洋蔥細胞質雄性不育系8A在花粉母細胞時期就發生了敗育[19]。小孢子敗育時期的差異可能是由材料不同造成的。

從形態學角度來看，大多數植物的小孢子敗育都涉及到了絨氈層的發育異常。絨氈層作為花藥壁最內層的特殊體細胞，與小孢子母細胞以及花藥發育后期的小孢子直接相互作用，在花粉發育過程中起著至關重要的作用，絨氈層以程序性死亡（PCD）的形式適時為小孢子發育提供營養和結構物質，分泌胼胝質酶，參與花粉粒外壁的形成，同時也為花粉的成熟提供空間。當環境條件改變或調控絨氈層細胞 PCD 的基因發生突變時，都會導致絨氈層細胞降解的提前或延遲，致使花粉發育受阻，并最終形成雄性不育[20-22]。王嬋等研究發現，大蔥不育系58A花藥絨氈層提前解體，影響了正常小孢子的形成，導致花粉敗育[23]。李園園等也認為，洋蔥不育系小孢子敗育與絨氈層提前衰退有關[12]，類似結論在辣椒[24]、油菜[25]、水稻[26]等作物上均有報道。洋蔥雄性不育系JA在四分體時期，絨氈層細胞出現細胞質、染色質濃縮，內質網溢滿，線粒體膨脹等程序性死亡現象，而其保持系四分體時期絨氈層發育到頂點，但未出現退化現象，直到游離小孢子時期絨氈層才退化分解，由此推斷不育系絨氈層的提前解離是造成小孢子營養不足、逐漸凋亡，最終導致敗育的原因之一。

形態學上的表現是基因表達的結果，本研究確定了洋蔥不育系JA小孢子敗育的發生時期和直接原因；但有關分子信息的研究還不明確，如哪些基因引起絨氈層提早解離，小孢子敗育除了線粒體基因的表達，與核基因是否還存在著某種關聯，洋蔥的雄性不育發生機理的研究無論是對雄性不育的利用，還是對洋蔥的雜交制種都具有重要意義，這也是下一步研究的方向。

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