1株綿羊溶血性曼氏桿菌的分離鑒定及致病性研究

李基棕+李文良+毛立+郝飛+楊蕾蕾+張紋紋+江杰元

摘要：為確定導(dǎo)致綿羊細(xì)菌性感染死亡的病原，從送檢病死綿羊肺臟中分離純化出1株細(xì)菌，并對其進(jìn)行培養(yǎng)特性觀察、生化反應(yīng)、PCR鑒定、藥敏試驗和動物致病性試驗。結(jié)果顯示，分離純化的細(xì)菌為革蘭氏陰性短桿菌，經(jīng)生化反應(yīng)和PCR鑒定為溶血性曼氏桿菌；該細(xì)菌對慶大霉素、頭孢噻肟高度敏感；對青霉素、四環(huán)素、紅霉素、利福平、卡那霉素、恩諾沙星和大觀霉素耐藥；將1×109 CFU/mL菌液10倍系列稀釋后感染6～8周齡小白鼠，該細(xì)菌對小白鼠的半數(shù)致死量為1×106.2 CFU/mL；死亡動物的剖檢病變與發(fā)病綿羊類似，并從病變器官內(nèi)分離到細(xì)菌。本研究為進(jìn)一步探討溶血性曼氏桿菌的致病機理奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：綿羊；溶血性曼氏桿菌；分離鑒定；致病性

中圖分類號： S855.1+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0156-03

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica，Mh）別稱溶血性巴氏桿菌，該菌屬于機會致病菌，可長期寄生于牛、綿羊、山羊等反芻動物及其他動物上呼吸道[1-2]。當(dāng)受到外界環(huán)境驟變、長途運輸?shù)却碳こ霈F(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，動物機體抵抗力下降，病菌可趁機侵入從而致病，病毒和支原體感染如綿羊肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌、副流感病毒等，可使得機體對溶血性曼氏桿菌更易感[3-4]。它能夠引起牛、羊肺炎，新生羔羊的急性敗血癥，給養(yǎng)牛業(yè)和養(yǎng)羊業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

2015年底，安徽宣城某養(yǎng)羊場發(fā)生疫情，死亡率達(dá)10%以上，發(fā)病羊主要表現(xiàn)為咳嗽、喘氣、流鼻涕等呼吸道癥狀，剖檢病變主要為肺臟出血、充血、水腫、實變。從發(fā)病羊肺臟中分離出1株菌株，通過生化鑒定和PCR鑒定，確定該分離株為溶血性曼氏桿菌。

1材料與方法

1.1主要試劑

綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、微量生化反應(yīng)管、抗菌藥物藥敏紙片均購自浙江杭州微生物試劑公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等均購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗動物

6～8周齡BALB/c小鼠，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.3病原的分離

無菌采集綿羊肺臟組織塊接種于鮮血瓊脂平板上，培養(yǎng)24 h后，挑取單個菌落進(jìn)行純化。挑取純化的菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.4生化試驗

將純化的菌落按照常規(guī)方法接種于葡萄糖、麥芽糖、甘露醇等生化鑒定管中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察其生化特性。

1.5PCR鑒定

參照Alexander等基于lkt基因設(shè)計的溶血性曼氏桿菌特異性引物（LktF：5′-GCAGGAGGTGATTATTAAAGTGG-3′；LktR：CAGCAGTTATTGTCATACCTGAAC）[4]進(jìn)行PCR擴增，預(yù)期擴增片段大小為206 bp。

以純培養(yǎng)細(xì)菌的染色體DNA為模板，PCR反應(yīng)體系為25 μL：Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板2 μL，引物P1、P2各1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，無菌水18 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。將目的片段切膠回收，并與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定正確后送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序。1.6耐藥性試驗

采用紙片擴散法進(jìn)行藥敏試驗，將分離的溶血性曼氏桿菌均勻涂布于鮮血瓊脂平板上，然后將藥敏紙片緊貼于瓊脂表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。

1.7小鼠致病性試驗

將分離純化的菌株接種于含犢牛血清的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，取菌液10倍系列稀釋，進(jìn)行活菌平板計數(shù)。取小鼠30只，隨機分為6組，將計數(shù)后的菌液進(jìn)行腹腔注射，菌液（108、107、106、105、104 CFU/mL）0.2 mL/只，測定其致病性。對照組注射等量的培養(yǎng)基。對死亡小鼠進(jìn)行剖檢，觀察組織病變，同時采集肺、脾、肝進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌的分離培養(yǎng)

病原菌在綿羊鮮血瓊脂平板上培養(yǎng)24 h后，形成圓形、光滑、濕潤、半透明、不溶血的小菌落。革蘭氏染色呈短小、多個的陰性菌（圖1）。

2.2生化鑒定

該菌可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，不發(fā)酵乳糖、吲哚、甘露糖，符合曼氏桿菌生化特性。

2.3PCR鑒定

將分離的病原菌進(jìn)行PCR擴增，得到與預(yù)期結(jié)果相符合的206 bp的特異性核酸片段（圖2）。測序結(jié)果表明，該分離株與GenBank中登錄的AF314503、M24179、M20730、AF314512、AF314520、AF314522、AS314519、AF314518、AY425280、AF314517、AF314521、AF314506同源性較高，均在94%以上。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該毒株與AF314503、M24179、M20730親緣關(guān)系最近，共同組成1組微小分支（圖3）。

2.4藥敏試驗

對分離到的菌株進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果表明，該細(xì)菌僅對慶大霉素和頭孢噻肟高度敏感；對鏈霉素、阿奇霉素、頭孢曲松和氨芐西林中度敏感；對青霉素、四環(huán)素、紅霉素、利福平、卡那霉素、恩諾沙星和大觀霉素不敏感（表1）。

2.5致病性試驗

過夜培養(yǎng)的細(xì)菌經(jīng)平板計數(shù)，菌液細(xì)菌數(shù)為1×109 CFU/mL，取菌液10倍系列稀釋腹腔接種小鼠，6 h后108 、107 CFU/mL 劑量組均有不同程度的發(fā)病，12 h后除105 、104 CFU/mL組外均出現(xiàn)死亡，對照組小鼠未見異常（表2）。因此，該分離菌對6～8周齡BALB/c小鼠的LD50為106.2 CFU/mL。

表2不同稀釋度溶血性曼氏桿菌的致病性試驗

試驗動物不同稀釋度的致死數(shù)10102103104105LD50

（CFU/mL）試驗鼠5/55/53/50/50/5106.2

3討論

溶血性曼氏桿菌是牛和羊鼻咽部的共生菌，主要引起肺炎、新生羔羊敗血癥、羊乳腺炎等，也是犢牛“船運熱”的主要病原。目前，該病原流行較廣，Shanthalingam等從40份發(fā)病羊肺臟中分離到8株溶血性曼氏桿菌[6]；馮旭飛等對四川地區(qū)臨床采集的120份肺組織和鼻拭子進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出率達(dá)51.67%[7]；李娟等、徐慧等和李雪霞等分別證實了該病原在江蘇、新疆和云南地區(qū)的流行[5，9-10]。

本研究從發(fā)病羊肺臟中分離并純化細(xì)菌，經(jīng)菌落形態(tài)、生化特征和PCR鑒定，最終確定其為溶血性曼氏桿菌。綜合臨床癥狀、染色鏡檢可以有效縮小病原菌范圍，結(jié)合PCR和測序鑒定，能夠更加準(zhǔn)確地確定該病原。致病性結(jié)果表明，108、107 CFU/mL劑量組感染小白鼠后，6 h出現(xiàn)不同程度發(fā)病癥狀，表現(xiàn)為精神沉郁、食欲廢絕等，12 h相繼出現(xiàn)死亡，而對照組未見異常。死亡小鼠的剖檢病變?yōu)榉闻K充血，肝臟和脾臟腫大等，從死亡小鼠臟器中分離出與感染菌株形態(tài)特征一致的菌株。

抗生素的使用是養(yǎng)殖戶預(yù)防和治療疾病的重要手段，細(xì)菌的耐藥性是困擾養(yǎng)殖戶的一大難題。本研究的試驗結(jié)果表明，溶血性曼氏桿菌對慶大霉素和頭孢噻肟高度敏感；對青霉素、四環(huán)素、紅霉素、利福平、卡那霉素、恩諾沙星和大觀霉素等藥物產(chǎn)生了耐藥性，與馮旭飛等[6]、Katsuda等[11]和 Lubbers 等[12]報道不盡相同，說明不同地域分離株耐藥性存在一定差異。該試驗結(jié)果也為發(fā)病羊群正確合理用藥提供參考。

目前，疫苗免疫是控制溶血性曼氏桿菌病的重要措施之一，由于各血清型之間交叉免疫保護(hù)性較低，疫苗的免疫譜窄，以至于本病未能得到有效的控制。因此，有待于研發(fā)預(yù)防溶血性曼氏桿菌病更佳的疫苗[13-14]。

參考文獻(xiàn)：

[1]Rice J A，Carrasco-Medina L C，Hodgins D C，et al. Mannheimia haemolytica and bovine respiratory disease[J]. Animal Health Research Reviews，2008，8（2）：117-128.

[2]陳艷紅，顏忠，查振林，等. 溶血性曼氏桿菌致病機制的研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（12）：153-155.

[3]韓猛立，康立超，鐘發(fā)剛，等. 細(xì)菌性牛呼吸道疾病的研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（5）：165-172.

[4]Alexander T W，Cook S R，Yanke L J，et al. A multiplex polymerase chain reaction assay for the identification of Mannheimia haemolytica，Mannheimia glucosidal and Mannheimia ruminalis[J]. Veterinary Microbiology，2008，130（1/2）：165-175.

[5]李娟，劉陽，彭欠欠，等. 羊溶血性曼氏桿菌的分離與鑒定[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（20）：96-97.

[6]Shanthalingam S，Goldy A，Bavananthasivam J，et al. PCR assay detects Mannheimia haemolytica in culture-negative pneumonic lung tissues of bighorn sheep（Ovis canadensis） from outbreaks in the western USA，2009-2010[J]. Journal of Wildlife Diseases，2014，50（1）：1-10.

[7]馮旭飛，刀筱芳，王志敏，等. 綿羊肺臟中溶血性曼氏桿菌的分離鑒定及其藥物敏感性分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（8）：224-228.

[8]馮旭飛，刀筱芳，李定菲，等. 溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌雙重 PCR 檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2014，44（6）：624-629.

[9]徐慧，賀云霞，龔玉梅，等. 溶血性曼氏桿菌的分離鑒定[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)（科技版），2009（12）：97-98.

[10]李雪霞，李富祥，趙文華，等. 云南羊溶血性曼氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，2014（1）：36-38.

[11]Katsuda K，Kohmoto M，Mikami O. Relationship between serotype and the antimicrobial susceptibility of Mannheimia haemolytica isolates collected between 1991 and 2010[J]. Research in Veterinary Science，2013，94（2）：205-208.

[12]Lubbers B，Hanzlicek G. Antimicrobial multidrug resistance and coresistance patterns of Mannheimia haemolytica isolated from bovine respiratory disease cases—a three-year （2009—2011） retrospective analysis[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2013，25（3）：413-417.

[13]Ayalew S，Confer A，Hartson S，et al. Immunoproteomic analyses of outer membrane proteins of Mannheimia haemolytica and identification of potential vaccine candidates[J]. Proteomics，2010，10（11）：2151-2164.

[14]Confer A，Ayalew S，Panciera R，et al. Recombinant Mannheimia haemolytica serotype 1 outer membrane protein PlpE enhances commercial M. haemolytica vaccine-induced resistance against serotype 6 challenge[J]. Vaccine，2006，24（13）：2248-2255.