榛子葉斑病病原菌生物學特性

孫俊

摘要：為了對遼寧省近年發生的新病害——榛子葉斑病病原菌的生物學特性進行系統測定。采用已經鑒定并報道的榛子葉斑病致病菌榛葉點霉（Phyllosticta coryli）菌株分別置于設定條件下，采用十字交叉法測量菌落直徑，分別測定該病原菌菌絲及分生孢子的生物學特性，對該病害的癥狀及病原菌形態進行描述，并對病菌的生物學特性進行系統測定。病菌菌絲生長以PSA培養基最適，能有效利用多種糖和氮源，分別以麥芽糖和甘氨酸最佳，菌絲適宜生長溫度為20～25 ℃，最適pH值為7～9，光照可促進菌絲生長，菌絲致死溫度61 ℃。病菌分生孢子萌發適宜溫度為15～25 ℃，最適pH值為5，黑暗條件下對孢子更易萌發，分生孢子致死溫度58 ℃。對病原菌菌絲和分生孢子的生物學特性系統測定結果表明，不同培養條件下，病原菌菌絲生長和分生孢子萌發均表現出明顯的差異。

關鍵詞：榛子；葉斑??；榛葉點霉；菌落直徑；生長溫度；生物學特性

中圖分類號： S436.64文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0101-03

榛子（Corylus heterophlla Fischl）為榛科榛屬木本植物的球果，別稱平榛、榛、棰子等。榛子為堅果，果形似栗子，紅棕色或金黃褐色，并著彩色條紋[1]，廣泛分布于東北、華北及陜西、甘肅等地。榛子有“堅果之王”的美稱，與扁桃、胡桃、腰果并稱“四大堅果”。其堅果營養豐富，用途廣泛，經濟價值高，是加工各種巧克力、糖果、冰淇淋以及榛子粉和榛子乳等高級營養品的重要原料[2]，還具有消炎、防心血管疾病、增強性功能、養顏護膚、延年益壽和抗衰老的功效[3]。而隨著榛子的營養價值和藥用價值逐漸被人們重視，種植面積快速增加，隨之而來是病害的發生嚴重。2011年8月，筆者在遼寧省瓦房店市炮臺鎮首次發現榛子葉斑病，隨后在遼寧省撫順章黨基地也發現該病的發生。

榛子葉斑病由葉點霉屬（Phyllosticta）真菌引起。Saccardo于1884年首次對榛子葉斑病進行記載，病原菌為榛葉點霉（Phyllosticta coryli）[4]。筆者曾對中國遼寧省新見發生的榛子葉部病害進行初步研究，并經柯赫氏法則證病，結合分離菌株的ITS序列分析，鑒定其致病菌為榛葉點霉，認為該病害為榛子葉斑病并對其進行了相關報道[5]。

園地調查發現，在榛子結果期，高溫高濕條件下的榛子葉斑病的發生率顯著增加。近年來，病害發生面積呈擴展趨勢。榛子葉斑病菌主要危害榛子的葉片，初期在葉片正反兩面均產生針尖大小的褐色斑點，隨后病斑逐漸擴大，病斑直徑3～9 mm，病斑邊緣顏色較中間顏色稍淺。嚴重時葉片干枯脫落，影響產量。濕度大時，病斑上生有小黑點，即為病菌的分生孢子器（圖1-A）。利用病菌孢懸液接種榛子葉片后，室溫保濕， 8～10 d葉片開始表現癥狀，葉面出現針尖大小褪綠斑，后擴展至圓形至橢圓形褐色病斑（圖1-B），表現癥狀與園地癥狀一致。

在PDA培養基中培養10 d左右，菌落呈灰白色，氣生菌絲短而致密；隨著培養時間的不斷加長，菌落顏色逐漸變深，呈灰黑色，在菌落上產生分生孢子器。分生孢子器球形，深褐色，直徑150～205 m（圖2-A）。分生孢子單胞，無色，卵圓形至橢圓形，大小在（2.4～4.5） m×（1.6～2.4） m（圖2-B）。

本研究針對榛子葉斑病致病菌的生物學特性進行了較為系統的測定，以便進一步為該病害的深入研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1病菌菌絲生長測定

將純化的菌株進行活化，在試驗設定條件下接種病菌單孢子，25 ℃恒溫培養，10 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。每處理5次重復[6]。

1.1.1培養基試驗選用PDA、PSA、OA、玉米粉培養基、水瓊脂培養基、Rechard、Czapek和孟加拉紅培養基。

1.1.2碳源試驗供試碳源為木糖、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、乳糖、山梨醇，PDA為基礎培養基，不同碳源等量置換葡萄糖[7]。

1.1.3氮源試驗供試氮源分別選用蛋白胨、丙氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸，查氏為基礎培養基，不同氮源等量置換KNO3。

1.1.4溫度試驗用PDA培養基，分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃不同溫度下恒溫培養。

1.1.5pH值試驗用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將PDA培養基pH值分別調節為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。

1.1.6光照試驗采用PDA平板培養基，分別置于24 h/d光照條件、12 h光照與12 h黑暗交替、24 h黑暗條件下培養。

1.2菌絲致死溫度試驗

將直徑為4 mm的菌片移入裝有10 mL無菌水的試管中，再將試管分別置于40～80 ℃（梯度為5 ℃）9個處理溫度的恒溫水浴鍋中處理10 min（預熱1 min），測得致死溫度范圍后，以1 ℃為梯度求得準確的致死溫度。試驗重復處理5次。

1.3分生孢子萌發測定

每處理重復5次，培養24 h后每次隨機鏡檢100個孢子，統計萌發率[6]。

1.3.1溫度對分生孢子萌發的影響經預備試驗后，選用孢子清水萌發法，將分生孢子配成濃度適當的懸浮液，滴于載玻片上，分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃條件下培養。

1.3.2pH值對分生孢子萌發的影響用磷酸鹽緩沖液將分生孢子懸浮液pH值調配為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，25 ℃恒溫培養。

1.3.3光照對分生孢子萌發的影響將分生孢子懸浮液滴在載玻片上，分別置于光照、光照與黑暗交替、黑暗條件下，25 ℃ 恒溫培養。

1.4分生孢子致死溫度測定

清水配制孢懸液，裝入試管中，置于35～60 ℃（梯度為 5 ℃）恒溫水浴鍋中處理10 min（預熱1 min），測得致死溫度范圍后，以1 ℃為梯度求得準確的致死溫度。

2結果與分析

2.1環境條件對病菌菌絲生長的影響

2.1.1培養基對菌絲生長的影響病菌菌絲在PSA培養基中生長最快，其次為PDA培養基；在Rechard培養基中生長速度最慢（表1）。從菌落形態和顏色看，病菌在水瓊脂中稀疏且菌落呈薄透明狀，在其他各培養基中均生長致密，在OA培養基、玉米粉培養基、PDA、PSA中菌落呈局部放射狀溝痕。

2.1.2碳源對菌絲生長的影響病原菌可利用多種糖，在以麥芽糖為碳源的培養基上菌絲生長最快，在以木糖為碳源的培養基上生長最慢（表2）。

2.1.3氮源對菌絲生長的影響病菌在不同氮源中生長差異顯著，其中尤以甘氨酸、蛋白胨最適合菌絲生長，在含精氨酸的培養基上菌絲幾乎不生長（表3）。

2.1.4溫度對菌絲生長的影響溫度對病菌生長影響明顯，菌絲在5～35 ℃范圍內均能擴展，20～25 ℃為最適宜溫度。低于5 ℃或高于35 ℃均不利于病菌菌絲生長（圖3）。

2.1.5pH值對菌絲生長的影響菌絲生長的pH值范圍為3～11，pH值3～4范圍內，隨pH值增高菌絲生長速度明顯加快；pH值7～9時，菌落生長速度最快，為該菌最適宜生長的pH值。可見，偏堿性條件有利于菌絲生長（圖4）。

2.1.6光照對菌絲生長的影響菌絲在光照條件、光暗交替條件下菌落直徑分別為6.50、6.45 cm顯著高于黑暗條件下的4.77 cm。說明不同光照處理對菌絲生長的影響存在一定差異，光照條件更有利于菌絲生長。

2.1.7菌絲致死溫度當處理溫度達61 ℃后，無菌絲生長，表明該菌菌絲致死溫度為61 ℃。

2.2環境條件對分生孢子萌發的影響

2.2.1溫度對孢子萌發的影響從圖5可以看出，溫度對分生孢子萌發的影響較大，15～25 ℃為萌發最適溫度，24 h萌發率接近80%，低于10 ℃或高于30 ℃嚴重抑制分生孢子的萌發。

2.2.2pH值對孢子萌發的影響病菌分生孢子萌發的pH值范圍為3～11，最適pH值為5。pH值3、11時，病菌分生孢子萌發率極低（圖6）。

2.2.3光照對孢子萌發的影響黑暗條件下孢子萌發率為71.67%，明顯高于光照條件下的35.46%和光暗交替條件下的53.07%，可見黑暗條件促進孢子萌發。

2.2.4分生孢子致死溫度測定病菌的分生孢子經≥58 ℃的幾個溫度處理后，均不萌發，表明該菌分生孢子的致死溫度為58 ℃。

3討論

Saccardo于1884年首次對榛子葉斑病進行記載，確定其病原為榛葉點霉[4]。于莉等于1994年首次在吉林地區發現榛葉點霉生于榛葉片上[7]。筆者于2013年在遼寧地區首次發現該病，并以報道[5]。此外，未見相關榛子葉斑病的報道。葉點霉能寄生于多種草本和木本植物的葉片上，在條件適宜的情況下，可對植株進行侵染并引起葉斑類病害，如小葉黃楊葉斑病（P. spinarum）[8]，龍眼白星?。≒. dimocarpi）[9]，八仙花葉斑病（P. hydrangeae）[10]等。

本試驗在鑒定確準為榛葉點霉基礎上，首次對該病原菌的生物學特性進行系統研究。研究結果表明，榛葉點霉的適宜生長范圍為20～25 ℃，最適溫度25 ℃，與此病在遼寧省5月下旬至6月上旬開始發病，6—7月高溫多雨季節有利于病害迅速傳播蔓延的發病規律相吻合。有關病菌的生物學特性研究，未見相關報道。在PDA培養基中，該菌的pH值適應范圍較寬，在pH值3～11下均可生長，在pH值7～9即偏堿性的條件下菌絲生長較快，而適合孢子萌發的pH值相對較窄為pH值4～8，在pH值5～7即酸性條件下孢子萌發率最高。該病原菌生長對營養要求并不嚴格，多數供試碳源均能滿足生長的需要，最適碳源為麥芽糖；最佳供試氮源為甘氨酸。病原菌分生孢子致死溫度經5次累積25次重復驗證確定為 58 ℃，表明其抗逆性較強，所以病菌在高溫季節可能具有較強的存活能力和侵染能力而導致病害擴大蔓延的趨勢不容忽視。

作為榛子生產上的新病害，筆者對其病原菌生物學特性進行測定研究，這對開展預測預報、適時綜合防治、有效控制榛子葉斑病的擴大蔓延具有一定理論指導意義。同時，對于病原菌致病機理等已開展深入研究，以期為經濟林作物的科學防治提供理論依據。

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