不同處理方式對內生細菌R15定殖數量和辣椒疫病防治效果的影響

羅志梅+趙寧+陳雙林+閆淑珍

摘要：為了檢測不同處理方式對熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）R15在辣椒根部定殖數量和防治辣椒疫病效果的影響，利用重復傷根法、重復傷根接種法、重復澆灌尿素溶液法、重復灌菌液接種法處理接種R15的辣椒苗，測定各個處理組在第一次接種后5～60 d的定殖數量，以及在接種10、25、40、55 d對辣椒疫病的防治效果。結果表明，重復傷根處理對R15菌株的定殖量增加有限；重復傷根接種能使內生細菌的定殖量明顯增加，但是多次傷根對植物體造成傷害，植株防治辣椒疫病的能力下降；重復澆灌尿素溶液使內生細菌的定殖量緩慢下降，但是防效提高不顯著；重復灌菌液接種能使內生細菌R15在辣椒體內的定殖數量大于105.61CFU/g，防治效果維持在80%～100%之間。因此，生防菌R15的使用方法是在第一次接種后，每隔15～20 d在辣椒根部進行菌液灌根，可以高效防治辣椒疫病。

關鍵詞：內生細菌；辣椒疫病；定殖；防效；接種方法；處理方式

中圖分類號： S182；S436.418文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0076-04

辣椒疫病是危害辣椒的主要病害之一，辣椒疫病俗稱死秧病，該病害是一種土傳病害，病原菌可以在土壤中長時間存活，使得該病害成為生產上最難防治的一種病害。從苗期到成株期都能引起嚴重的危害，在高溫、高濕條件下可在短期內引起大面積死苗、爛葉和爛果，不僅嚴重影響了辣椒的產量和品質，甚至導致絕收，是一種毀滅性病害。目前防治辣椒疫病主要以化學防治為主，例如甲霜靈、三乙膦酸鋁、氯唑靈、霜霉威鹽酸鹽等[1]。但長期使用這些殺菌劑容易引起病原菌的抗藥性，導致用藥量不斷提高，同時容易造成藥物殘留、污染環境、威脅人類健康等問題。植物體內存在大量具有拮抗活性的菌株，它們對由病原真菌、細菌、寄生線蟲引起的植物病害有著不同程度的防治作用，通過不同的生防機制，使植物免受或減輕危害，有些還具有促生作用。內生細菌由于定殖在植物體內，不易受環境影響，目前已經引起植物學家、微生物學家等的重視，成為研究的熱門課題。近年來已從自然界中分離篩選到大量對辣椒疫病具有防控作用的生防菌[2-6]。

但目前利用內生細菌防治植物病害，還沒有在農業生產上大面積推廣應用，主要是因為應用效果不穩定。田間環境和植物體微生態環境中許多因子都會影響內生細菌防病作用的發揮。Weyens等認為內生細菌防效不穩定的原因之一是定殖量不穩定[7]。例如2株產生1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶的內生細菌DP24和XG32都能夠定殖在辣椒體內，DP24和XG32在辣椒根部達到最大定殖量的時間分別為接種后7、12 d，隨后逐漸下降，30 d后在根部檢測不到這2種細菌的存在[8]。筆者所在實驗室篩選到1株能有效防治辣椒疫病的內生細菌Pseudomonas fluorescens R15，它能穩定定殖在辣椒體內，并且在定殖量高于6.3×105 CFU/g，防治辣椒疫病的效果達到100%。但是定殖一段時間后，其定殖數量逐漸下降，防治效果也逐漸降低，定殖30 d后防治辣椒疫病的效果為70.8%，防治效果不太理想[9]。文才藝等研究了內生細菌EBS05在小麥體內的定殖動態及其對小麥紋枯病的防治作用，發現接種初期EBS05在小麥體內的定殖量逐漸增加，10～12 d定殖數量達到最大，防治效果最好，建議在應用EBS05進行小麥紋枯病防治時，分別于發病高峰期即冬前期和返青期的前10 d左右施藥可達到理想的防治效果[10]。現階段關于如何使內生細菌成功定殖，并確保一定的定殖數量以及達到良好的防治效果方面的研究尚未見報道。

內生細菌成功接入宿主植物的技術已經成熟，例如通過傷根、灌根、蘸根、噴灑、涂抹、浸種等人工接種方法能使內生細菌成功定殖在植物體內。內生細菌采用不同的接種方式以及宿主的健康狀況對內生細菌在植物體內的成功定殖并發揮作用起著決定性作用[11]。目前還未見報道關于使接種內生細菌在宿主體內穩定保持一定菌體數量的處理方法。本研究通過對成功定殖內生細菌的辣椒苗進行不同處理，從定殖數量和對辣椒疫病的防效上研究了這些處理方法對內生細菌R15菌株在辣椒根部的定殖量及防治效果的影響，為內生細菌在農業上更有效防治病原菌提供理論依據及技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料及菌種培養

菌株R15經鑒定為熒光假單胞菌Ⅱ型（Pseudomonas fluorescens biovar Ⅱ）；定殖試驗和防效試驗表明其具有在辣椒體內定殖的能力和防治辣椒疫病的特性[9]。

辣椒疫霉菌孢子懸浮液的制備：辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）由山東農業大學植物保護學院張修國教授惠贈。辣椒疫霉菌接種到燕麥培養基（50 g燕麥，1 000 mL蒸餾水，20 g瓊脂）上，置于25 ℃光照培養箱中培養7 d，用蒸餾水洗下孢子囊，配制孢子囊懸浮液。置4 ℃冰箱內30 min，誘導孢子釋放，紗布過濾，用無菌水稀釋到105個孢子/mL。

辣椒品種為加州特大牛角椒，種子購自江蘇明天種業科技有限公司，催芽后播種到無菌土中，2片子葉時移栽至 10 cm×15 cm（直徑×高）的花盆中，每盆4株苗，4～6葉期時供試驗用。

精甲霜·錳鋅，購自先正達（中國）投資有限公司。

1.2接種劑的準備

參照Simons等的方法[12]對R15進行抗生素標記，篩選到抗300 μg/mL鏈霉素的突變株，其菌落形態及拮抗活性與原菌株基本一致。將標記的R15菌株接種到裝有含鏈霉素的50 mL牛肉膏蛋白胨培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min振蕩48 h。將發酵好的菌株發酵液離心留下菌體，懸浮在無菌水中，利用分光光度計把濃度調為108 CFU/mL。

1.3試驗設計和內生細菌定殖數量調查方法

選取4～6葉期長勢一致的辣椒盆栽苗，用傷根法接入內生細菌，每株接種12.5 mL，分別在接種15、30、45 d后進行如下處理，處理1：對接種的辣椒苗每隔15 d傷根并接種1次，共接種3次；處理2：對接種的辣椒苗每隔15 d傷根1次，共傷根3次；處理3：對接種的辣椒苗每隔15 d在根部周圍澆灌0.16%尿素溶液1次，共3次；處理4：對接種的辣椒苗每隔 15 d 灌根接種菌液1次，共接種3次。設第1次接種后不處理為對照組，同時設不接種內生細菌為空白組。每組12盆，每盆4株苗，3次重復。分別在第1次接種5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d后隨機選取3棵辣椒苗，分別剪取根部，清洗，晾干，稱質量后，用75%乙醇表面消毒1 min，無菌水洗5次，1%次氯酸鈉處理 5 min，無菌蒸餾水洗滌5次，取最后1次清洗的無菌水 200 μL 涂于牛肉膏蛋白胨平板上，若沒有長出細菌，就證明消毒徹底。將用清水洗凈的根置于無菌的組織勻漿器中搗碎，再用無菌蒸餾水梯度稀釋，每個處理設3個重復。取稀釋梯度為10-2、10-3、10-4、10-5的稀釋液分別涂布于含 300 μg/mL 鏈霉素的牛肉膏蛋白胨平板上，每個梯度3個重復，于28 ℃培養72 h后計數。

1.4對辣椒疫病防效的試驗方法

試驗設計同“1.3”節，每個處理（包括對照組）分別在第1次接種10、25、40、55 d后接種辣椒疫霉孢子懸浮液，每株接 3 mL，25～28 ℃保濕7 d后調查發病情況。同時設不接種病原菌為空白對照，設清水澆苗后接病原菌作為陰性對照及噴灑農藥（精甲霜·錳鋅）接種病原菌的作為陽性對照。

1.5調查方法和數據統計

辣椒疫病發病情況分級標準參照曹云等的方法[13]。0級：沒有發病；1級：莖基稍變黑，但植株健康不萎蔫；2級：莖基變黑1～2 cm，葉片萎蔫，下部葉片偶有脫落；3級：莖基變黑超過2 cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯；4級：莖基變黑縊縮，除生長點外全部落葉或整株萎蔫；5級：植株全部枯死。

病情指數=∑（各級發病株數×各級代表數值）/（總株數×發病最重級的代表數值）×100；

發病率=發病株數/總株數×100%；

防治效果=（對照區病情指數-處理區病情指數）/對照區病情指數×100%。

利用SPSS 17.0進行數據處理和方差分析，顯著性水平設定P<0.05，采用Origin 8.0軟件進行圖形繪制。

2結果與分析

2.1不同處理對R15菌株在辣椒根內定殖動態的影響

由圖1可知，對照組在接種5～15 d，R15菌株在辣椒根內定殖數量呈上升趨勢，在15 d時達到最大值，為 105.86 CFU/g，15～30 d呈現逐漸下降趨勢，30 d后定殖數量基本趨于穩定，保持在105.22 CFU/g左右。總體趨勢為先增加后降低，最后趨于穩定。未接種R15菌株的辣椒苗沒有分離出目的菌株。重復傷根接種（處理1）R15菌株定殖數量有大幅度增加，定殖數量最大，為106.06 CFU/g。只傷根處理方法（處理2）雖然能刺激內生細菌定殖數量的變化，但與重復傷根接種比較不能使定殖數量明顯增加和維持較高的定殖量。接種后澆灌尿素溶液（處理3）R15菌株定殖數量比對照組下降慢，當內生細菌的定殖數量達到最低時，再次澆灌尿素溶液（40 d），R15菌株的量有稍微增加的趨勢。多次灌根菌液（處理4）R15菌株的定殖數量明顯增加，每次灌根處理后R15菌株最大定殖量分別增加到105.79（30 d）、106.03（45 d）、106.06 CFU/g（60 d），并且在50 d后，內生細菌R15菌株的數量高于多次傷根接種組（處理1）的定殖數量。

2.2內生細菌R15接種后在辣椒根內的定殖動態與其防效的關系

由圖2可知，接種內生細菌R15后，辣椒苗不進行任何處理，防治辣椒疫病的效果與定殖數量呈正相關，即內生細菌定殖數量越高，防治效果越好；定殖數量趨于穩定，防治效果也穩定。總體來看，內生細菌R15對辣椒疫病的效果呈先下降后穩定的趨勢，最低防治效果為58.3%。對未定殖內生細菌R15的辣椒苗在接種辣椒疫霉前先噴灑農藥，7 d后調查辣椒的發病情況，農藥組的防效維持在85.4%左右。25 d后農藥組控制辣椒疫病的效果均高于接種內生細菌R15處理組。而清水處理后接種辣椒疫霉組的辣椒苗全部枯死。

2.3重復傷根接種內生細菌定殖動態與防治辣椒疫病關系

由圖3可知，多次重復傷根接種處理內生細菌的定殖量都保持在較高水平，盡管在10、25 d防治辣椒疫病的效果較高，但是在40 d后防治效果卻出現下降趨勢，55 d防治效果僅為75.6%，低于農藥組的防治效果。

2.4重復傷根內生細菌在辣椒體內定殖動態與防效的關系

由圖4可知，盡管傷根能使內生細菌的定殖量有所增加，但是對辣椒疫病的防治效果卻逐漸降低，防治辣椒疫病的效果與內生細菌的定殖數量不成正相關關系。并且在每次處理后10 d接種辣椒疫霉，防治病原菌的效果均低于農藥組，防治辣椒疫病的效果不理想。

2.5重復澆灌尿素內生細菌定殖動態與防效的關系

由圖5可知，內生細菌R15防治辣椒疫病的效果與“22”節中相似，即防治辣椒疫病的效果隨著內生細菌定殖數量的變化而變化。接種后25 d對病原菌的防效明顯高于“2.2”節中同一天的防效。可能由于澆灌尿素溶液，內生細菌定殖數量下降緩慢，防治病原菌的效果有所增加，但提高不顯著（P>0.05）。

2.6重復灌根接種內生細菌在辣椒根部定殖動態與防效的關系

由圖6可知，接種R15后進行灌根菌液處理，防治辣椒疫病的效果分為91.7%（25 d）、100%（40 d）、100%（55 d），定殖數量維持在較高水平，對疫病的防治效果也較高。與“2.3”節相比，第1次接種25 d后，防治辣椒疫病的能力較低，但是40 d后，重復傷根接種組的防效逐漸下降，而重復灌根接種組的防效依然保持在較高水平。