鋸末牛糞堆肥微生物多樣性的宏基因組學分析

王慧麗+江娟

摘要：運用宏基因組技術研究不同比例鋸末牛糞堆肥產物中微生物的組成和分布。結果表明，牛糞與鋸末質量比為2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1的3個堆肥樣本中微生物可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）有較大的差異，其中含量最高的3個門的微生物為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，在不同樣本中它們的含量也有較大差異。從屬水平分析，含量最高的是甲基單胞菌屬、噬氫菌屬、固氮菌屬和寡養單胞菌等營養轉化和合成的菌屬。降解纖維素和木質素的也有一定的含量，特別是假單胞菌屬含量較高。經過對堆肥產物基本性質及其微生物的分析發現，當牛糞與鋸末的比例為2 ∶1時，堆肥樣品中的營養轉化和合成菌屬以及去除污染菌屬都高于其他2個樣品，堆肥效果較好。

關鍵詞：牛糞堆肥；宏基因組；微生物；鋸末；可操作分類單元（OUT）；分子生態學依據

中圖分類號： S141.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0028-05

近年來，由于產業結構調整，我國規模化養殖業發展迅速。以生產牛奶為主的奶牛養殖業產生了可觀的經濟效益，但是同時也帶來了大量的牛糞等固體有機廢棄物，為了保護環境、實現養殖業的可持續發展，必須進行牛糞的無害化處理和資源化利用，堆肥處理是目前有機固體廢物處理的重要方式。堆肥的本質是微生物群落結構演替協同作用于堆肥基質的生化過程[1-2]。在細菌和真菌等微生物的作用下，降解有機物，殺死病原菌，促進有機質穩定化和腐殖化，最終達到無害化和資源化的目的，并生成大量可被植物吸收利用的有效態氮、有效態磷、有效態鉀化合物和其他有機物質作為土壤肥力活性物質。因此，研究微生物的群落結構對于了解微生物的協同關系、調控堆肥以及研究高效穩定的復合菌系都有重要意義。堆肥過程中的微生物菌系復雜，變化較大，而且其中大多數菌系不能分離培養，因而常規的試驗方法和手段難以完全認識和真實反映微生物的群落組成[3-4]。宏基因學技術分析克服了傳統微生物分析僅限于可分離培養組分的缺陷，通過對樣品中微生物基因序列的分析，可以快速確定微生物的種類和豐度，主要采用16S rDNA序列分析進行微生物的群落分析檢測出樣品中大量的低豐度生物。目前，宏基因組學技術已經應用于海洋、土壤、石油以及人體胃腸道等多個方面[5-7]，但用于堆肥研究的較少。在牛糞堆肥中，通常以農作物秸稈、木質、鋸末廢棄物等作為輔料，起到加速堆肥過程和保證堆肥效果的作用[8]。本研究就地取材，在牛糞中添加不同比例的鋸末，采用宏基因組學技術對不同比例鋸末添加產生的微生物進行對比分析，旨在明確堆肥微生物的群落組成，合理評價堆肥效果，為堆肥工藝研究應用提供一定的分子生態學依據。

1材料與方法

1.1堆肥試驗及樣品采集

試驗所用的牛糞和鋸末分別從湖南省武漢市南湖養殖場和永宏木材加工廠收集（鋸末作為調節劑）。堆肥試驗在實驗室內進行，以鋸末為調理劑，與牛糞充分混合后進行堆肥試驗，設置柱體高度為0.8 m，直徑為0.5 m，實行人工翻堆通氣，每3 d進行1次手工翻堆。在3個相同的堆肥容器內，將牛糞與鋸末分別按照2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1比例混合，堆肥45 d時取樣，分別在每個柱體的上、中、下采集樣品，然后將3個取樣點的樣品混合為1個樣品，3個堆肥容器所取的樣品分別編號為1、2、3號樣品。

1.2宏基因組DNA的提取和16S rDNA測序

對3個樣本采用MIO-BIO的PowerSoil DNA Isolation Kit進行基因組DNA抽提，分別取3 μL進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

根據illumina Miseq高通量測序要求，進行雙向測序，設計16S V4～V5區域和帶有5′Miseq接頭-barcode-測序引物-特異引物-3′的融合引物。細菌16S V4～V5引物序列如下：515F，5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-

NNNNNNNN-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGC

CAGCMGCCGCGGTAA-3′；926R，5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-NNNNNNNN-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCACCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′。文庫構建采用2步PCR擴增的方法：首先采用特異引物擴增目的片段，將目的片段進行膠回收，而后將回收產物作為模板進行二次PCR擴增，目的是將illumina平臺測序所需的接頭、測序引物和barcode添加到目的片段的兩端。將PCR擴增產物電泳檢測效果好的樣品于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，取 3 μL 回收產物進行電泳檢測。PCR產物采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進行回收，微量熒光核酸定量儀和Qubit 3.0試劑進行定量，均一化混勻后送樣到上海微基生物公司測序。

1.3數據分析方法

1.3.1測序獲得序列的質量控制在試驗過程中，測序產物可能含有非特異性擴增片段，利用特異性引物信息可以將其去除；序列中可能含有模糊堿基、單堿基高重復區以及PCR過程中產生的一些嵌合體，將這些序列納入分析范圍會降低分析質量，因此去除此部分序列，可得到供精準分析的優化序列。

1.3.2可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）分析首先提取非重復序列，堿基完全一致序列為重復序列只保留1條；然后與SILVA v119數據庫（http：//www.arb-silva.de/）中的aligned（16S/18S，SSU）核糖體序列比對[9]，使用uchime軟件檢測PCR擴增中產生的嵌合體序列（Chimeric序列）并去除嵌合體序列；最后使用mothur V.1.33.3軟件進行距離計算與OTU聚類分析[10]。OTU是在系統發生學或群體遺傳學研究中為了便于分析，人為給某一個分類單元（品系、屬、種、分組等）設置的同一標志。要了解一個樣品測序結果中的菌種、菌屬等數目信息，就須要對序列進行聚類操作（cluster）。通過聚類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，1個小組就是1個OTU。可根據不同的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，通常在97%的相似水平下對OTU進行生物信息統計分析。在進行OTU分類學分析時，首先將每一條優質序列都與數據庫進行比對，找出其最相近且可信度達80%以上的種屬信息；之后將每一個OTU中的所有序列進行類比，找出同一OTU中不同序列的最近祖先的種屬信息。將OTU綜合分類表中的信息按照門、綱、目、科、屬、種6個水平分別提取信息，分別統計各樣品在不同分類水平上的相對豐度。

1.3.3分級發育樹在前述分類學分析中，已經得到每個OTU的豐度和對應的分類學信息，使用軟件MEGAN（http：//ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan/）導入分析數據中樣品包含的物種及物種豐度[11]，通過交互式搜索NCBI的分類數據庫信息，以樹狀圖形式表現物種的豐度情況和群落結構，反映微生物的組成情況。這種方法構建的系統樹不同于利用序列堿基差異構建的系統發育樹，不能反映物種間的時間進化信息。

1.3.4系統發生進化樹在分子進化研究中，系統發生的推斷能夠揭示出有關生物進化過程的順序，了解生物進化歷史和機制，可以通過序列間堿基的差異構建進化樹。選擇OTU的代表序列根據鄰位比對法（neighbor-joining）使用MEGA軟件構建進化樹，結果以列圖或者圈圖的形式呈現。

2結果與分析

2.1堆肥樣品基本性質

針對堆肥初始和堆肥45 d后的混合料及滲濾液進行基本的性質檢測，包括混合料的含水率、pH值、碳氮比，滲濾液的CODCr（化學耗氧量）和BOD5（生化耗氧量）去除率。同時，在堆肥45 d后提取稀釋液，注入無菌去離子水，加入適量浸泡后的種子，在培養箱中28 ℃培養1周，觀察種子發芽率，具體數值見表1和表2。

初始堆肥料的含水率在55%～65%之間，被認為是比較適合堆肥發酵的條件[12]。因此，1號樣可能有較好的發酵條件（表1）。通過表2可以看出，在堆肥45 d后，3個樣品均達到了基本腐熟化，種植發芽率均>50%。1號樣中滲濾液CODCr和BOD5的去除率、種子發芽率較高。

2.2宏基因組DNA的提取

DNA提取是微生物種群分析的先決步驟，提取純度將影響后續的試驗和分析。試驗對3個樣本進行基因組DNA抽提后，分別取3 μL進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1-A。其中，從上至下條帶依次為9 000、5 000、3 000、2 000、1 000、500 bp，上樣量為3 μL，亮帶為30 μg/uL，其余條帶均為10 ng/μL，基因組條帶可見，后續試驗根據濃度加入 5～50 ng進行后續PCR擴增試驗。

二次PCR擴增后PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1-B所示，由此可見，二次PCR擴增后條帶單一，亮度適中，可進行后續膠回收試驗。將PCR擴增產物電泳檢測效果好的樣品，于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，取3 μL回收產物進行電泳檢測。檢測結果（圖1-C）顯示，PCR產物回收效果良好。

2.3樣本微生物群落OTU分布

通過MiSeq測序，1、2、3號樣分別獲得了34 317、34 128、35 180條細菌的16S rDNA序列。利用雙端測序的成對序列（pair end reads）間的重疊部分將成對序列拼接成1條序列，拼接好的全部樣本序列長度統計主要分布在400～450 bp之間。

通過OTU分析可以獲得不同樣本中微生物群落的種屬信息，筆者測序的3個樣本總共獲得了3 677個OTU類別，3個樣本分別獲得的OTU數目為1 631、1 867、1 899個，不同樣本間的交集如圖2所示。

OTU是根據宏基因組測序中的序列信息來獲得可能的物種分類信息，一般屬水平的OTU居多。1號樣在變形菌門（Proteobacteria）有較多的OTU分布，2號樣在擬桿菌門（Bacteroidetes）有較多的OTU分布；3號樣在變形菌門（Proteobacteria）有1個OTU，是3個樣本所有OUT中含量中最高的，這個OTU是嗜甲基菌科（Methylophilaceae），這是一種利用甲醇和甲胺為唯一碳源和能源的革蘭陰性桿菌，主要在活性污泥中[13]，這可能與3號樣中牛糞含量較高有關。

在這些不同的OTU中發現了一些有潛在功能并且和堆肥過程或肥料肥力相關的微生物類別，如能降解纖維素的細菌噬纖維菌科（Cytophagaceae）在3個樣本中的豐度分別為0.008 5、0.006 4、0.001 6，特別是噬纖維菌目（Cytophagales）在1號樣中達到1%。已報道的可以降解木質素的細菌中厭氧梭菌（Clostridium）和假單胞菌屬（Pseudomonas）都有一定的含量[14]，其中厭氧梭菌菌株Clostridium sp. enrichment culture clone VanCtr97在3個樣本中的含量分別為0.001 9、0002 3、0.001 3；假單胞菌屬（Pseudomonas）在3個樣本中的含量更是高達0.034 1、0.008 2、0.014 9。假單胞菌屬是重要的解脂肪菌，能溶解礦物質，提供養分供應[14-15]，因此假單胞菌屬是堆肥產物肥力的重要組成部分。此外，其他營養轉化和合成相關的細菌[15]，如亞硝化單胞菌（Nitrosomonas sp.）、非共生固氮固氮螺菌（Azospirillum sp.）和共生固氮根瘤菌（Rhizobium sp.）在各個樣本中都有一定的比例，從 0.000 1～0.008不等。

2.4樣本微生物種群門和屬水平分布

種屬信息按照分類學水平分為多列，將物種的門、綱、目、科、屬、種6個水平的信息及相關的其他分類信息的全部內容都進行分類分析。樣品間可以通過基于群落組成的層次聚類分析（bray-curtis算法）進行相似度樹分析（圖3）。從圖3可以看出，其中門水平含量最多的5個細菌門類及其在1、2、3號等3個樣本中的比例分別是：變形菌門（Proteobacteria），0.694、0.386、0.555；擬桿菌門（Bacteroidetes），0.174、0.389、0.202；厚壁菌門（Firmicutes），0.034、0.067、0.083；螺旋菌門（Spirochaetae），0.017、0.049、0.030；放線菌門（Actinobacteria），0.016、0.013、0.050。并且這3個樣本在含量最多的3個門類細菌的比例上都有較大差別。門是非常大的分類單元，須要進行屬水平的比較小而常用的分類單元的細菌分類比較，但是有很多序列不能確定到具體的屬中，3個樣本分別有42%、70%、58%的OTU不能確定到屬的水平。

已知屬信息的OTU中按豐度排序的前50個OTU分布如圖4所示，其中能確定屬類別的OTU中含量最高的5個屬及其比列分別是：甲基單胞菌屬（Methylomonas），0.019、0.022、0.049；噬氫菌屬（Hydrogenophaga），0.036、0.018、0.025 9；固氮弧菌屬（Azoarcus），0.069、0.006、0.003；固氮捲菌屬（Azonexus），0.004、0.007、0.033；寡養單胞菌（Stenotrophomonas），0.043、0.003、0.002。這5個都屬于變形菌門，其中固氮弧菌屬和固氮捲菌屬都屬于紅環菌科的固氮菌屬。這5個含量最高的屬都是屬于營養轉化和合成的菌屬，如甲基單胞菌屬能利用甲烷、甲醇等含甲基的單碳化合物為碳源和能源，寡養單胞菌可以降解有機農藥，并且同時將農藥轉化為生物活性更高的代謝產物[16]。

2.5樣本微生物群落分類學系統樹分析

將測序得到的物種豐度信息回歸至NCBI數據庫的分類學系統關系樹中，可以從整個分類系統上全面了解測序的環境樣品中所有微生物的進化關系和豐度差異，圖5是對已知屬信息的前50個屬類別進行分類學分級進化樹分析結果。從圖5可以看出，2號樣的變形菌門（Proteobacteria）含量比1、3號樣少，其中的α、β、γ變形菌綱都是如此，但是2號樣的δ變形菌綱細菌豐度反而是最高的。黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）在1號樣中所占比列稍多，但是在黃單胞菌科下屬的寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）中1號樣大大超過其他2個樣本之和，而同是黃單胞菌科下屬的沙單胞菌（Arenimonas）則在1號樣中基本沒有，更為極端的是兩面神菌屬（Janibacter）和甲烷氧化菌甲基彎曲菌屬（Methylosinus）等菌屬基本上只在3號樣中存在。

3結論

本研究通過對不同比例牛糞和鋸末進行堆肥試驗，采用宏基因組技術檢測堆肥后混合料的微生物組成。3個樣的種子發芽率都在50%以上，可見堆肥樣品基本完全腐熟，可直接作為肥料使用，各種基本性質稍有差別。3個樣品的微生物種群都比較豐富，說明微生物之間有良好的協同關系；在3個樣品中門水平含量最多的5個細菌門類分別是變形桿菌、擬桿菌、壁菌門、螺旋菌門和放線菌門，其屬水平含量最多的是甲基單胞菌和固氮菌等營養轉化和合成的菌屬。降解纖維素的微生物隨著鋸末所占比例的減少而減少，1號樣中的營養合成菌屬包括甲基單胞菌屬、噬氫菌屬、固氮菌屬和寡氧單胞菌，其含量均高于2、3號樣，說明1號樣肥力更高，同時1號樣中噬纖維菌科比例較高，可見堆肥已經充分腐熟。1號樣中的寡氧單胞菌比例較高，也印證了1號樣的CODcr和BOD5去除率較高。因此，牛糞與鋸末的比例為2 ∶1的堆肥效果要優于3 ∶1、4 ∶1。

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