Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655海藻糖酶Tre F的重組表達及性質研究

于林港宿玲恰吳敬，

（1. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，無錫 214122；2. 江南大學生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122）

Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655海藻糖酶Tre F的重組表達及性質研究

于林港1宿玲恰2吳敬1，2

（1. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，無錫 214122；2. 江南大學生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122）

海藻糖酶（Trehalase）是一種海藻糖水解酶，能夠特異性的將海藻糖分解為兩分子的葡萄糖。為了將Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655的海藻糖酶基因Tre F在E. coli BL21（DE3）中重組表達和應用，該研究通過PCR擴增獲得E. coli str. K-12 substr. MG1655的海藻糖酶基因Tre F，構建了基因工程菌E. coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-Tre F。對重組菌進行搖瓶發酵，25℃，IPTG濃度為0.4 mmol/L時，搖瓶發酵誘導24 h時得到最高酶活為107 U/mL。進一步研究了海藻糖酶的酶學性質，發現該海藻糖酶的最適pH為7.0，最適溫度為50℃；此外，將該酶應用于海藻糖的水解，起始海藻糖濃度為300 g/L，初始pH 7.0、反應溫度30℃，加酶量為84 U/g，反應36 h，葡萄糖轉化率可達98.4%。該研究是首次將E. coli str. K-12 substr. MG1655海藻糖酶基因Tre F在E. coli BL21（DE3）宿主中重組表達的報道。

海藻糖酶；基因克隆；重組表達；酶學特性

海藻糖（Trehalose）分子是由兩個吡喃葡萄糖環分子以α，α-1，1-糖苷鍵連接而成的一種十分穩定的非還原二糖［1］。海藻糖廣泛存在于自然界的生物體內，包括細菌、真菌、昆蟲、低等植物、脊椎動物，特別在真菌和昆蟲中的含量非常高，是國際上最近開發的主要低聚糖之一［2-5］。雖然海藻糖的來源很廣泛，但能在體內大量積累海藻糖的生物并不是很多［6］。目前正在研究和開發的海藻糖制備方法主要有微生物抽提法、發酵法、酶轉化法及基因重組法［6］。然而從微生物中提取海藻糖成本高，提取源有限，很難實現大規模工業化生產；發酵法生產海藻糖存在轉化率低，發酵液成分復雜，海藻糖的提取、精制困難等問題；基因重組法生產海藻糖目前研究還不完善，技術有待發展，不能廣泛應用于工業生產。目前工業上常用的方法是采用麥芽糖或淀粉等為底物，利用與海藻糖合成有關的酶的作用轉化成海藻糖。然而采用酶轉化方法生產海藻糖時，依然會有一些問題需要解決，如在將海藻糖制備提取后仍然會產生含有葡萄糖和少量海藻糖等組分的母液，造成資源的浪費。如果能將母液中的海藻糖水解為葡萄糖，就可以實現母液的有效再利用，減少資源浪費。因此，本研究將對海藻糖的水解酶進行研究，具有重要的研究價值和應用前景。

海藻糖酶（EC：3.2.1.28）是一種海藻糖水解酶，能夠特異性的將海藻糖分解為兩分子的葡萄糖［7］。海藻糖酶最早是Bourquelot于1893年在黑曲霉中發現的，1895年Fischer在釀酒酵母里也發現了海藻糖酶［8］。隨后，科研人員在不同的生物里不斷地發現和鑒定了不同的海藻糖酶，這些生物包括細菌、酵母、真菌、昆蟲、線蟲、植物和脊椎動物［9-12］。微生物中海藻糖的水解酶分為兩類［13］：中性海藻糖酶（NTH，由nth1 和nth2 基因編碼）和酸性海藻糖酶（ATH，由ath1 基因編碼）。其中酸性海藻糖酶定位于液泡，最適pH在4.5左右；而中性海藻糖酶位于細胞質，負責主要的胞內海藻糖分解，最適pH在7.0左右［14-16］。本研究以Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655為出發菌株克隆出其中性海藻糖酶基因Tre F，并在E. coli BL21（DE3）中進行高效表達，進而對其酶學特性和應用性能進行了研究，為海藻糖酶的后續制備和應用研究奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 E. coli str. K-12 substr. MG1655、E. coli JM109、E. coli BL21（DE3）菌株及表達載體pET-24a（+）均為本實驗室保藏。

1.1.2 試劑與培養基 Taq酶、T4 DNA連接酶、PrimerStarTMHS DNA聚合酶、限制性內切酶Nde I和Hind III、堿性磷酸酶（calf intestine alkaline phosphatase，CIAP）、瓊脂糖和核酸分子量標準均購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質粒小提試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；蛋白電泳試劑盒和蛋白分子量標準均購自上海碧云天生物技術有限公司；Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（細菌）和SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）均購自上海生物工程股份有限公司；酵母粉和胰蛋白胨均購自英國Oxiod公司；所有引物均由上海睿迪生物科技有限公司合成；其他國產分析純試劑均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

LB液體培養基（g/L）：NaCl 10.0，酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0。LB固體培養基：添加質量體積分數為1.5%-2.0%的瓊脂至LB液體培養基。LB-Kan培養基：在LB培養基中添加100.0 μg/mL的Kan。TB培養基（g/L）：甘油5.0，酵母粉24.0，胰蛋白胨12.0，KH2PO42.3，K2HPO4×3H2O 16.4。TB-Kan培養基：在TB培養基中添加30.0 μg/mL的Kan。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 E. coli str. K-12 substr. MG1655基因組DNA的提取按照上海生工的細菌基因組抽提試劑盒說明書提取獲得。

1.2.2 引物設計與基因克隆 根據GenBank中海藻糖酶的同源序列（NC_000913.3）為模板，按需要加入適宜的內切酶（Nde I和Hind III）位點，設計出一對PCR引物P1/P2：上游引物P1：5'-GGAATTCCA TATGCTCAATCAGAAAATTCAAAACC-3'；（下劃線處為酶切位點Nde I）；下游引物P2：5'-CCCAAGCTTA TGGTTCGCCGTACAAACCAATTA-3'。（下劃線處為酶切位點Hind III）；以E. coli str. K-12 substr. MG1655基因組DNA為模板，以P1/P2為引物進行PCR擴增。PCR擴增體系（50 μL）：ddH2O 33.5 μL，dNTP混合物4 μL，5×PS Buffer 10 μL，模板1 μL，上游引物P10.5 μL，下游引物P20.5 μL，PrimerSTARTMHS DNA聚合酶0.5 μL。PCR擴增條件為：于95℃預變性5 min，然后開始循環，首先于98℃變性10 s，然后于55℃退火5 s，最后于72℃延伸110 s，循環30次后于72℃延伸10 min，并于4℃保溫。

將PCR產物進行瓊脂糖（1%）凝膠電泳驗證，將驗證正確的PCR產物進行膠回收，膠回收后的產物在PCR儀或者恒溫水浴鍋中72℃反應10 min完成平末端加A，然后將加A后的產物進行DNA產物純化，最后將純化后產物連接至pMD19-T simple vector，并轉化E. coli JM109感受態細胞，涂布LBKan固體培養基，于37℃恒溫培養箱培養過夜。挑取陽性克隆至LB-Kan液體培養基，抽提質粒經限制性內切酶Nde I和Hind III雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證，并將驗證正確的序列送睿迪基因測序。測序正確的重組質粒命名為pMD19T-Tre F，-80℃甘油管保存。

1.2.3 E. coli重組表達質粒的構建 分別用限制性內切酶Nde I和Hind III對測序正確的pMD19T-Tre F質粒和表達載體pET-24a（+）進行雙酶切，用DNA膠回收試劑盒將目的片段回收，然后用T4連接酶將目的基因和表達載體16℃連接過夜，轉化E. coli JM109感受態細胞，涂布LB-Kan固體培養基，于37℃恒溫培養箱培養過夜。挑取陽性克隆至LBKan液體培養基，抽提質粒經限制性內切酶Nde I和Hind III雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證。將驗證正確的序列送睿迪基因測序。測序正確的重組質粒命名為pET-24a（+）-Tre F，-80℃甘油管保存。將測序正確的質粒轉化表達宿主E. coli BL21（DE3），-80℃甘油管保存。

1.2.4 重組菌的誘導表達和優化 將重組菌E. coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-Tre F接種至LB-Kan液體培養基，于37℃，200 r/min培養8 h，以5%的接種量轉接上述菌液至50 mL TB-Kan培養基中，于37℃，200 r/min培養至OD600約為1.0時，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，于25℃，200 r/min誘導發酵。

在搖瓶發酵的基礎上優化了不同誘導劑濃度和不同的誘導溫度對產酶的影響。本實驗通過改變單因子的方法對誘導條件進行優化，根據以上測酶活方法獲得的酶活大小作為優化參考標準，每個因素做3個平行。

1.2.5 重組菌生長曲線的測定和粗酶液的制備 為了檢測重組菌隨著時間的生長情況，分別在不同的誘導時間點取樣1 mL發酵液，在吸光值600 nm測量菌體的OD600。取一定量發酵液離心收集得到菌體并采用去離子水洗滌3次后，當OD600低于5.0時直接用1 mL 50 mmol/L pH7.0 的K2HPO4-KH2PO4緩沖液懸浮菌體，當菌體生長至OD600大于5.0時，采用緩沖液稀釋至5.0，超聲破碎（破碎2 s、間歇3 s，總時間10 min）后離心10 min，破壁上清即為Tre F粗酶液，單位體積酶活根據相應體積發酵液菌體稀釋倍數折算得出。

濃縮粗酶液的制備：取500 mL發酵液離心收集得到菌體并采用去離子水洗滌3次后，用100 mL 50 mmol/L pH 7.0 K2HPO4-KH2PO4緩沖液懸浮菌體，超聲破碎（破碎2 s、間歇3 s，總時間30 min）后離心10 min，破壁上清即為濃縮的Tre F粗酶液。

1.2.6 酶活力測定 將1 mL適當濃度（80 g/L）的海藻糖溶液和0.9 mL的50 mmol/L，pH7.0的磷酸緩沖液充分混勻，在37℃預熱10 min，加入100 μL適當稀釋的酶液，反應10 min后加入3 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS），煮沸7 min迅速冷卻，加蒸餾水定容至15 mL，在540 nm下測吸光度（以緩沖液同樣操作作為空白對照）［17］。

在上述條件下，將每分鐘水解1 μmol海藻糖生成2 μmol的葡萄糖所需酶量定義為一個酶活單位（1U）。

1.2.7 海藻糖酶的酶學性質 （1）溫度對重組Tre F酶活力的影響：分別測定Tre F在30-70℃（間隔5℃）下的酶活，將Tre F最高酶活設定為100%。實驗方法同上，每個梯度設置3個平行實驗。（2）pH對重組Tre F酶活力的影響：分別測定Tre F在pH 4.5-8.0（間隔為0.5）的50 mmol/L檸檬酸-K2HPO4緩沖液中的酶活，將Tre F最高酶活設定為100%。實驗方法同上，每個梯度設置3個平行實驗。（3）重組Tre F穩定性：將Tre F分別置于最適pH下，溫度為30℃、37℃以及50℃的恒溫水浴鍋中，測定不同時間的殘留酶活，將未經過熱處理的樣品的酶活設定為100%。實驗方法同上，每個時間點設置3個平行實驗。

1.2.8 加酶量對葡萄糖轉化率的影響 用pH值為7.0的50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液配制反應底物海藻糖溶液（300 g/L），分別加入12 U/g、24 U/g、36 U/g、48 U/g、60 U/g、72 U/g、84 U/g、96 U/g、108 U/g、120 U/g及132 U/g濃縮后的粗酶液，在30℃，150 r/min的水浴搖床中反應36 h。用HPLC檢測反應液中海藻糖的殘余量和葡萄糖的生成量，計算海藻糖轉化生成葡萄糖的轉化率，每個梯度做3個平行。

葡萄糖含量的測定：產物中的葡萄糖糖含量采用HPLC檢測。色譜條件為：安捷倫 1200 HPLC色譜儀，色譜柱 APS-2 HYPERSIL（250 mm×4.6 mm），示差檢測器為安捷倫 2410；流動相為80%（V/V）乙腈和水的混合溶液，流速為0.8 mL/min，柱溫設定為40℃。葡萄糖轉化率的計算：

2 結果

2.1 目的基因的克隆

以E. coli str. K-12 substr. MG1655的基因組DNA為模板，用引物P1/P2進行PCR擴增海藻糖酶基因Tre F，將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，擴增出的DNA片段約在1 650 bp處，與預期大小相符（圖1）。將目的基因與pMD19-T simple vector載體連接并轉化E. coli JM109感受態細胞，提取質粒用Nde I和Hind III雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳（圖2）顯示約為2 600 bp和1 650 bp兩條帶，與預期相符。測序結果顯示目的片段全長1 650 bp，編碼549個氨基酸，通過DNAMAN軟件比對與E. coli str. K-12 substr. MG1655的Tre F基因序列（NC_000913.3）相似度達到99%，蛋白質序列相似度為100%。可以推斷克隆的基因為E. coli str. K-12 substr. MG1655的海藻糖酶Tre F基因。

2.2 重組表達質粒的構建

將測序正確的目的基因用Nde I和Hind III雙酶切，與同樣酶切的表達載體pET-24a（+）進行連接，連接產物轉化E. coli JM109，挑取單克隆提取質粒用Nde I和Hind III雙酶切驗證，結果如圖3所示，瓊脂糖凝膠電泳顯示約為5 300 bp和1 650 bp的兩條片段，重組表達質粒構建成功，命名為pET-24a（+）-Tre F。

圖1 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳驗證

圖2 pMD19T-Tre F Nde I和Hind III雙酶切瓊脂糖凝膠電泳驗證

圖3 pET-24a（+）-Tre F Nde I和Hind III雙酶切瓊脂糖凝膠電泳驗證

2.3 重組酶在E. coli中的表達

將驗證正確的重組質粒pET-24a（+）-Tre F轉化E. coli BL21（DE3）感受態細胞，涂布LB-Kan固體平板，挑取單菌落到LB-Kan培養基中培養過夜，以5%的轉接量將菌液接種到TB-Kan培養基，待OD600約為1.0時，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，于25℃，200 r/min誘導，分別在不同的時間進行取樣測定重組菌的生長曲線和產酶曲線，如圖4所示，發酵培養26 h時，OD600為11.9，海藻糖酶活達到最高為103 U/mL。對樣品進行SDS-PAGE電泳鑒定，如圖5所示，重組菌E. coli BL21（DE3）/ pET-24a（+）-Tre F成功表達了分子量約為63 kD的蛋白，與預期結果一致。

圖4 重組菌E. coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-Tre F的細胞生長情況和產酶情況

圖5 重組Tre F的SDS-PAGE凝膠電泳分析

2.4 重組菌誘導條件的優化

2.4.1 IPTG最佳誘導濃度的確定 本研究選取0.1、 0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L等不同的IPTG濃度對重組菌進行誘導發酵。如圖6所示，重組菌的OD600隨著IPTG誘導濃度的增加呈現降低的趨勢；而重組酶的酶活則是隨著誘導劑濃度呈現先增加后下降的趨勢，當IPTG的濃度低于0.4 mmol/L時，重組菌海藻糖酶的酶活力隨著IPTG濃度的增加而提高，0.4 mmol/L時酶活達到最高為103 U/mL；當IPTG誘導濃度超過0.4 mmol/L時，重組菌的酶活開始下降。因此，重組菌的最佳IPTG誘導劑濃度為0.4 mmol/L。

圖6 IPTG濃度對重組菌的生物量和產酶情況的影響

2.4.2 最佳誘導溫度的確定 溫度的高低決定著微生物細胞內新陳代謝的酶催化反應，低的誘導溫度可能導致重組菌生長和產酶較慢，而高的誘導溫度又可能導致重組蛋白易折疊錯誤而以包涵體的形式從而導致酶活很低，因此需要對重組菌的誘導溫度進行優化。本研究選取了3個不同的誘溫度25℃、30℃和37℃，考察了誘導溫度對重組菌的生長和產酶的影響，結果如圖7所示。重組菌的OD600隨著誘導溫度的增加顯示為先增加后降低，30℃時重組菌的OD600最高為12.5，25℃為11.5，37℃最低為11；而重組菌的酶活則是隨著溫度升高而降低，在25℃時酶活最高為107 U/mL，30℃時酶活為87.5 U/mL，當誘導溫度為37℃時酶活最低僅有35 U/mL，可以看出低溫有利于重組酶的表達。由于低于25℃的溫度不易控制，成本較高，故本研究選取發酵產酶的最佳溫度為25℃。

2.5 重組Tre F的酶學性質

2.5.1 溫度對重組Tre F酶活力的影響 將酶液分別置于不同溫度進行酶反應并測定酶活，以最高酶活為100%，結果如圖8，海藻糖酶反應液在50-60℃時活性較高，在50℃時酶活最高，而當溫度超過60℃后酶活急劇下降，由此可推斷出海藻糖酶的最適反應溫度為50℃。

圖7 誘導溫度對重組菌的生物量和產酶情況的影響

圖8 反應溫度對重組Tre F酶活力的影響

2.5.2 pH對重組Tre F的影響 待測樣品分別置于不同pH的緩沖液中測定酶活，以最高酶活為100%，結果見圖9。當pH小于7.0時海藻糖酶的酶活隨著pH的增加而上升，海藻糖酶在pH 7.0處酶活最高，而當pH大于7.0時海藻糖酶的酶活隨著pH的增加而逐漸下降。由此可判斷海藻糖酶的最適反應pH為7.0。

2.5.3 重組Tre F的溫度穩定性 將粗酶液分別置于30℃、37℃、50℃的水浴鍋進行保溫，測定其殘留酶活。結果（圖10）顯示，Tre F在30℃放置24 h，酶活基本無下降，可見重組酶在30℃下具有良好的穩定性；在37℃下放置時，Tre F半衰期約為12 h，具有較好的穩定性；而在50℃下放置時，酶迅速失活，半衰期大約只有10 min，可見重組酶在較高溫度條件下穩定性較差。綜上所述，Tre F在30℃時具有良好的穩定性。

圖9 pH對重組Tre F酶活力的影響

圖10 重組Tre F在30℃和37℃的溫度穩定性

2.6 加酶量對葡萄糖轉化率的影響

由于重組Tre F在30℃的穩定性較好，保溫24 h酶活基本不變，因此酶轉化時選取30℃進行酶反應。葡萄糖轉化率結果如圖11所示，相同的反應時間內葡萄糖的轉化率隨著海藻糖酶的加酶量的逐漸增加而增大，當單位加酶量為24 U時轉化率就能達到84.3%，當單位加酶量為36 U時轉化率能達到92.2%，繼續提高加酶量到單位加酶量為84 U時轉化率達到最高98.4%，之后提高加酶量葡萄糖的轉化率基本不變。因此，重組Tre F酶轉化反應的最適條件為：單位加酶量為84 U，反應溫度為30℃，pH為7.0，反應時間為36 h。

圖11 加酶量對葡萄糖轉化率的影響

3 討論

目前，國內外研究較多的海藻糖酶主要有昆蟲來源，如綠盲蝽（Apolygus lucorum）［18，19］、大豆蚜（Aphis glycines）［20］、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）［21］、甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）［22］和煙粉虱（Bemisia tabaci）［23］等，真菌來源如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等，植物來源如擬南芥（Arabidopsis thaliana）等，而對細菌來源的海藻糖酶進行研究的報道并不多。譚永安等［19］將綠盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因在宿主E. coli BL21（DE3）中能夠高效表達，純化獲得的重組蛋白具有較高的海藻糖水解活性，最適溫度為55℃，最適pH為7.0，在最適溫度和最適pH下純化獲得的重組蛋白酶活達到（228.59±4.62）nmol·μg-1·min-1。呂燁等［24］構建了酵母海藻糖酶缺失突變株，使突變株的海藻糖積累量和細胞密度均高于親本，提高了其冷凍、高溫、高糖和酒精耐性。郭蓓等［25］將擬南芥海藻糖酶基因在E. coli BL21（DE3）菌株中進行高效誘導表達，純化獲得的海藻糖酶蛋白在試管條件下具有較高水解活性的海藻糖酶（報道未提到酶活力情況），其最適溫度為45℃。

本研究以E. coli str. K-12 substr. MG1655的基因組為模板，克隆PCR擴增出其海藻糖酶基因Tre F，選用pET-24a（+）為表達載體，構建了高效原核表達重組質粒，將重組菌轉化表達宿主E. coli BL21（DE3），對重組菌進行誘導表達，并對重組菌進行誘導條件優化，最佳誘導溫度為25℃，最佳IPTG誘導濃度為0.4 mmol/L。在最佳誘導條件下：海藻糖酶的酶活可達到107 U/mL。此外，通過酶學研究，發現海藻糖酶的最適反應溫度為50℃，最適pH為7.0。將該酶用于海藻糖水解時，當底物海藻糖濃度為300 g/L，加酶量為每克底物84 U，初始pH 7.0，溫度為30℃，150 r/min，反應36 h，葡萄糖的轉化率最高為98.4%。這一過程說明，從E. coli str. K-12 substr. MG1655中克隆得到的海藻糖酶基因Tre F不但能夠在E.coli BL21（DE3）中完整表達，而且得到的重組蛋白對海藻糖具有很好的水解活性。本研究是首次將E. coli str. K-12 substr. MG1655的海藻糖酶基因Tre F進行重組表達的報道，得到的重組蛋白具有較高的海藻糖水解活性（107 U/mL），在30℃具有很好的穩定性（放置24 h酶活基本無下降），將之應用于海藻糖的水解，以300g/L的海藻糖溶液為底物水解率高達98.4%。與其他來源的海藻糖酶相比，E. coli str. K-12 substr. MG1655來源的海藻糖酶基因在表達宿主E. coli BL21（DE3）重組表達是同源表達，具有表達效率高、操作簡單、應用效果好等優點。

4 結論

構建了重組菌E. coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-Tre F，對誘導溫度、IPTG誘導濃度進行發酵優化，獲得最佳誘導發酵條件：25℃，0.4 mmol/L IPTG，誘導24 h后，Tre F酶活達到107 U/mL。Tre F酶的最適反應pH為7.0，最適反應溫度是50℃。此外，將該酶用于海藻糖水解，當底物海藻糖濃度為300 g/L，單位底物加酶量為84 U，初始pH 7.0，溫度為30℃，150 r/min，反應36 h，葡萄糖的轉化率達到98.4%。

［1］ 馬文錦, 劉樹興, 潘巨忠, 等. 海藻糖的生產制備及應用前景［J］. 現代農業科技, 2007, 24：199-201.

［2］Elbein AD, Pan YT, Pastuszak I, et al. New insights on trehalose：a multifunctional molecule［J］. Glycobiol, 2003, 13（4）：17-27.

［3］Elbein AD. The metabolism of α, α-trehalose［J］. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 1974, 30：227-256.

［4］Wingler A. The function of trehalose biosynthesis in plants［J］.Phytochemistry, 2002, 60（5）：437-440.

［5］Frison M, Parrou JL, Guillaumot D, et al. The Arabidopsis thaliana trehalase is a plasma membrane-bound enzyme with extracellular activity［J］. FEBS Letters, 2007, 581（21）：4010-4016.

［6］胡宗利, 夏玉先, 陳國平, 等. 海藻糖的生產制備及其應用前景［J］. 中國生物工程雜志, 2004, 24（4）：44-48.

［7］Alabran DM, Ball DH, Reese ET . Comparison of the trehalase of Trichoderma reesei with those from other sources［J］. Carbohydrate Research, 1983, 123（1）：179-181.

［8］Kopp M, Müller H, Holzer H. Molecular analysis of the neutral trehalase gene from Saccharomyces cerevisiae［J］. Journal of Biological Chemistry, 1993, 268（7）：4766-4774.

［9］Hill EP, Sussman AS. Purification and properties of trehalase（s）from Neurospora［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1963, 102（3）：389-396.

［10］Killick KA. Alterations in trehalase solubility during development in the cellular slime mould Dictyostelium discoideum［J］. Microbiology, 1985, 131（2）：273-278.

［11］Merdinger E, Lange C F, Booker BF. Isolation and identification of trehalase from Pullularia pullulans［J］. Journal of Bacteriology, 1971, 106（3）：1034-1035.

［12］Retief LW, Hewitt PH. Purification and properties of trehalase from the harvester termite, trinervitermes trinervoides［J］. Insect Biochemistry, 1973, 3（12）：345-351.

［13］Z?hringer H, Burgert M, Holzer H, et al. Neutral trehalase Nth1p of Saccharomyces cerevisiae encoded by the NTH1 gene is a multiple stress responsive protein［J］. FEBS Letters, 1997, 412（3）：615-620.

［14］Alizadeh P, Klionsky DJ. Purification and biochemical characterization of the ATH1 gene product, vacuolar acid trehalase, from Saccharomyces cerevisiae［J］. FEBS Letters, 1996, 391（3）：273-278.

［15］Amaral FC, Van Dijck P, Nicoli JR, et al. Molecular cloning of the neutral trehalase gene from Kluyveromyces lactis and the distinction between neutral and acid trehalases［J］. Archives of Microbiology, 1997, 167（4）：202-208.

［16］Jules M, Beltran G, Fran?ois J, et al. New insights into trehalose metabolism by Saccharomyces cerevisiae：NTH2 encodes a functional cytosolic trehalase, and deletion of TPS1 reveals Ath1pdependent trehalose mobilization［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74（3）：605-614.

［17］鐘國華, 胡美英, 林進添, 等. 鬧羊花素-Ⅲ 對菜青蟲海藻糖含量及海藻糖酶活性的影響［J］. 華中農業大學學報, 2000, 19（2）：119-123.

［18］譚永安, 肖留斌, 孫洋, 等. 綠盲蝽水溶性海藻糖酶 ALTre-1基因原核表達, 純化與酶學特性［J］. 中國農業科學, 2013, 46（17）：3587-3593.

［19］譚永安, 肖留斌, 柏立新, 等. 綠盲蝽膜結合型海藻糖酶ALTre-2 基因表達, 純化及酶學特性［J］. 棉花學報, 2015, 25（5）：396-402.

［20］Bansal R, Mian MAR, Mittapalli O, et al. Molecular characterization and expression analysis of soluble trehalase gene in Aphis glycines, a migratory pest of soybean［J］. Bulletin of Entomological Research, 2013, 103（3）：286-295.

［21］于彩虹, 黃瑩, 林榮華, 等. 五種昆蟲可溶性海藻糖酶活性比較［J］. 植物保護, 2013, 39（4）：5-9.

［22］Chen J, Tang B, Chen H, et al. Different functions of the insect soluble and membrane-bound trehalase genes in chitin biosynthesis revealed by RNA interference［J］. PLoS One, 2010, 5（4）：e10133.

［23］Wang J, He W, Su Y, et al. Molecularcharacterization of soluble and membrane-bound trehalases of the whitefly, Bemisia tabaci［J］. Arch Insect Biochem Physiol, 2014, 85（4）：216-233.

［24］呂燁, 肖冬光, 和東芹, 等. 酵母海藻糖酶缺失突變株的構建及其耐性［J］. 微生物學報, 2008, 48（10）：1301-1307.

［25］郭蓓, 胡磊, 蓋穎, 等. 擬南芥海藻糖酶基因克隆及其在大腸桿菌中高效表達與功能研究［J］. 微生物學通報, 2008, 35（2）：241-248.

（責任編輯 狄艷紅）

Recombinant Expression and Characterization of Trehalase Tre F from Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655

YU Lin-gang1SU Ling-qia2WU Jing1，2
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. School of Biotechnology and Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）

Trehalase is a trehalose hydrolase，which can distinctively catalyze trehalose into two molecules of glucose. In order to have a recombinant expression and application of the trehalase gene Tre F from Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 in E. coli BL21（DE3），the Tre F was amplified by PCR，and a recombinant strain E. coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-Tre F was constructed. The highest activity reached 107 U/mL when the strain was cultured in shake flask for 24 h at induction temperature 25℃and IPTG induction concentration 0.4 mmol/L. Further study of the enzymatic properties indicated that the optimal pH and temperature was 7.0 and 50℃，respectively. The crude enzyme was used in the hydrolysis of trehalose. The reaction conditions for the conversion was as the following：initial trehalose concentration 300 g/L，initial pH 7.0，reaction temperature 30℃，enzyme concentration 84 U/g. When the reaction was performed under this specified condition，the glucose yield reached the maximum of 98.4 % at 36 h. This paper is the first report on the recombinant expression of trehalase gene Tre F of E. coli str. K-12 substr. MG1655 in E. coli BL21（DE3）.

trehalase；gene cloning；recombinant expression；enzyme properties

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.023

2016-09-30

國家自然科學基金杰出青年基金（31425020），江蘇省2015年度普通高校研究生實踐創新計劃（SJLX15_0543）

于林港，男，碩士，研究方向：工業微生物與酶技術；E-mail：13771099654@163.com

吳敬，女，博士生導師，研究方向：食品與發酵；E-mail：jingwu@jiangnan.edu.cn