甜葉菊中新KAH基因的克隆及表達模式分析

朱靜雯 郭書巧 束紅梅 鞏元勇 蔣璐 倪萬潮

（江蘇省農科院經濟作物研究所，南京 210014）

甜葉菊中新KAH基因的克隆及表達模式分析

朱靜雯 郭書巧 束紅梅 鞏元勇 蔣璐 倪萬潮

（江蘇省農科院經濟作物研究所，南京 210014）

為進一步揭示甜菊糖苷生物合成途徑的分子調控機制，探究甜菊糖苷在甜葉菊葉片中積累差異原因。從不同甜葉菊材料中分別克隆關鍵分支點酶KAH的編碼基因，并對獲得的核苷酸序列進行生物學功能分析和預測。結果顯示，最終共獲得6條高度同源的核苷酸序列，個別關鍵堿基的突變造成序列開放讀碼框位置和大小的顯著差異，共預測獲得7個不同KAH編碼基因。KAH1、KAH2同時存在于SR1、SR3、鑫豐3號、譜星1號和守田3號中，KAH3存在于江甜1號和守田3號中，KAH4存在于江甜3號中，KAH5、KAH6、KAH7均存在于SR2中且SrKAHs在甜菊糖苷積累多的品種和組織部位中表達更高。7個KAH基因均含有P450保守結構域且均屬于CYP716家族成員；亞細胞定位預測KAH2和KAH4定位于細胞質其他5個均定位在葉綠體中。甜葉菊中KAH編碼基因的數目、氨基酸長度及在亞細胞結構的定位差異或許是導致甜葉菊不同品種和組織中SrKAHs表達和功能差異的主要原因并最終糖苷的積累差異。

甜葉菊；甜菊糖苷；KAH；CYP716

甜菊糖苷（SGs）是菊科植物甜葉菊次生代謝產生的一類四環二萜類物質，因其高甜度、低能量且無毒副作用等優勢逐漸成為替代蔗糖的理想甜味劑［1，2］。隨著人們對甜菊糖苷的關注，甜菊糖苷生物合成途徑的研究也日益成為科研工作的熱點［3］。甜菊糖苷主要在甜葉菊的綠色組織中合成［4］，整個生物合成途徑共包括16個酶促反應［5］。初始的七步反應用來合成異戊烯焦磷酸（IPP），IPP與甲基赤蘚糖醇途徑（MEP）合成的二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）經過接下來的4個酶促反應生成內根-貝殼杉烯酸［6］，這四步反應在甜葉菊體內與赤霉素的生物合成共享［6］。最后5個酶促反應則是甜菊糖苷生物合成所特有［6］，其中關鍵節點酶促反應由不同的內根-貝殼杉烯酸脫氫酶（KAH）控制，在13位碳位置脫氫就生成為不同甜菊糖苷的基本骨架的甜菊醇，若在7位碳位置脫氫則合成赤霉素［7，8］。因此不同的KAH編碼基因調控植物體內赤霉素和甜菊糖苷的合成。

甜菊糖苷生物合成途徑中所特有的酶促反應中的酶已經被成功純化并驗證其催化活性［9，10，11］，編碼這些酶的基因也逐漸被克隆。目前4種糖基轉移酶的編碼基因均已被成功克隆，其中SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1不 僅 在 異 源 酵 母 表達［10，12］中成功驗證相對應的糖基轉移酶活性，并且用農桿菌介導轉錄水平沉默技術在甜葉菊葉片中也成功證明其對應的糖基轉移酶活性［5］；Wang等［13］首次克隆到具有將甜菊雙糖苷轉化為甜菊單糖苷活性的糖基轉移酶基因SrUGT91d2，并成功通過異源體系大腸桿菌驗證了其編碼活性。關鍵分支點的內根-貝殼杉烯酸脫氫酶的編碼基因目前已有的研究中共克隆到8個，包括已驗證無催化酶活的KAH_ AEH65420、KAH_AEH65421和KAH_AEH65423共3個基因［1］，未驗證催化活性的FJ494665［14］，已驗證具有催化活性的包括來源于甜葉菊的KAHn2、KAH_ACD93722、DQ398871.3和來源于擬南芥并經過優化的CYP714A2［13］。通過農桿菌介導技術瞬時沉默DQ398871.3會顯著降低所有甜菊糖苷的含量［5］；KAHn2和KAH_ACD93722在異源體系大腸桿菌中內根-貝殼杉烯酸轉化活性極低；來源于擬南芥的CYP714A2最早在異源酵母體系中發現具有貝殼杉烯酸脫氫酶活性，通過將其氮端進行不同的改造優化，最終可轉化甜菊醇濃度最高達到15.47 mg/L［13］。

綜上所述，甜菊糖苷生物合成途徑的關鍵節點酶-內根-貝殼杉烯酸脫氫酶（KAH）的編碼基因雖然克隆成功，但真正具有高效轉化活性的內源基因并沒有，即使是改造后的外源CYP714A2活性也遠低于預期值。因此本研究從多個甜葉菊材料的基因庫中擴增KAH編碼基因，并結合生物信息學等手段對獲得的不同KAH基因進行分析、生物功能預測和表達分析，為篩選高效轉化活性的新KAH編碼基因、進一步基因改造及異源高效表達等提供更多內源KAH候選基因，同時也進一步揭示甜菊糖苷積累的分子調控機制。獲得內源性的具有高效轉化活性的KAH基因將進一步完善甜菊糖苷生物合成的分子調控機制并為高效異源合成甜菊糖苷提供候選基因，對甜菊糖苷生物合成機制的研究和工業生產都具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

植物材料：江甜1號、江甜3號、鑫豐3號、譜星1號、守田3號；本實驗室甜葉菊新品系SR1、SR2和SR3。載體：pMD-19T。

1.2 方法

1.2.1 基因序列的獲得

1.2.1.1 不同KAH基因核酸序列的獲得 從NCBI數據庫中下載已報道的編碼內根-貝殼杉烯酸脫氫酶的SrKA13H的核酸序列，根據其保守區序列設計擴增不同甜葉菊中該酶的編碼基因，引物序列KAH-F（5'-3'）：TAGGTA CCGAATGATTCAAGTTCTAACACCGAT；KAH-R（5'-3'））：GCGAGCTCCACATAATCTGTA ACTACCAATAA。采集田間不同品種甜葉菊開花前的葉片，用OMEGA公司的RNA提取試劑盒提取不同甜葉菊品種的總RNA，并用TAKARA公司的反轉錄試劑盒反轉錄得到不同品種的總cDNA。分別用不同品種的cDNA做模版，以上述引物擴增不同品種的KAH編碼基因。PCR擴增到的不同序列分別酶連到克隆載體pMD-19T后轉化入大腸桿菌（EH5α）中，搖菌并菌液PCR驗證酶連成功后送至Invitrogen 公司測序獲得核酸序列。選擇來源于總糖苷含量最高的SR2和相對含量較低的守田3號的多個菌落進行測序，其他品種僅進行單菌落測序。

1.2.1.2 擬南芥P450家族基因序列的獲得 擬南芥中細胞色素P450家族基因的核酸和氨基酸序 列 均 從P450數 據 庫（http://drnelson.uthsc.edu/ CytochromeP450.html）下載獲得。

1.2.2 不同KAH基因的生物信息學分析 不同KAH基因的核苷酸和氨基酸序列差異分析由軟件DNAMAN完成，基因的開放閱讀框（ORF）預測由在線軟件ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder/）和DNAMAN完成，核苷酸翻譯為氨基酸序列由Primer premier 5.0完成，核苷酸序列的保守區域分析在NCBI在線分析完成（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/guide/domains-structures/），不同KAH基因和擬南芥中P450家族成員的進化樹分析由MEGA5.1 軟件完成。

1.2.3 定量PCR檢測SrKAHs表達 分別采集收獲期江甜3號、守田3號和譜星1號的葉片，苗期守田3號植株頂部葉片（頂葉）、中間部位葉片（中葉）、植株近基部葉片（底葉）、莖和根五個不同組織部位的植物樣品，采用OMEGA公司針對多糖多酚樣品的RNA提取方法獲得其RNA并通過TAKARA公司的定量專用反轉錄試劑盒獲得cDNA。利用ABI Primer Express設計SrKAHs特異擴增定量引物（F：ACCCATCGCGGTTTGAAG；R：CCCCTCCAAATGGAACATATGT），采用ABI 7500定量PCR儀檢測SrKAHs在甜葉菊不同品種和不同組織部位中的表達。

2 結果

2.1 不同品種甜葉菊中KAH編碼序列分析

2.1.1 不同KAH基因的核苷酸序列分析 從不同甜葉菊品種中克隆到的KAH核苷酸序列經DNAMAN軟件分析結果（圖1）表明，共擴增到6組7個不同KAH編碼序列。守田3號中擴增到兩個不同的KAH核酸序列，其中一條KAH核酸序列與來源于SR1、SR3、鑫豐3號、譜星1號KAH核酸序列完全一致，長度為1 501 bp，經分析后存在兩個開放閱讀框分別命名為KAH1和KAH2，另一個KAH核酸序列與來源于江甜1號的KAH序列完全一致，長度為1 502 bp，命名為KAH3；江甜3號中擴增到一個不同于其他品種但同樣長為1 502 bp的KAH核酸序列，命名為KAH4；本實驗室甜葉菊新品系SR2中共擴增到3個長度不一的KAH核酸序列，較短的一條為1 498 bp，兩條較長的為1 503 bp，分別命名為KAH5、KAH6和KAH7（表1）。通過比對結果可知，這6組不同的核酸序列高度同源，由于開放閱讀框的位置差異，7個不同KAH基因的編碼序列在3'端高度保守，核酸序列差異均是個別堿基的缺失或改變。

表1 不同甜葉菊品種中KAH基因簡介

2.1.2 不同KAH基因的氨基酸序列分析 從8個甜葉菊品種中共擴增到6組不同的KAH核酸序列，經過ORF Finder和DNAMAN分析預測后共獲得7個不同ORF。來源于守田3號等品種的KAH1和 KAH2分別編碼236和208個氨基酸；從江甜1號擴增獲得的KAH3核酸序列翻譯成476個氨基酸；江甜3號的KAH核酸序列預測得到3個ORF但經分析只有編碼208個氨基酸的最長的ORF具有保守序列命名為KAH4；來源于SR2的3個KAH核 KAH5編碼336個氨基酸，KAH6和KAH7均編碼476個氨基酸（表1）。核酸序列的個別堿基改變導致了ORF的位置和大小的變化，因此氨基酸同源性比對結果顯示7個氨基酸序列差異較大（圖2-A）。根據同源性可以分為3組，第1組的KAH2、KAH4雖然長度比KAH5短，但氨基酸序列均與KAH5的部分氨基酸序列完全匹配；第2組KAH3、KAH6和KAH7雖然均為476個氨基酸，但同源性為98%；這兩組KAH序列的同源度為96%；第3組的KAH1與其他6個基因的同源度僅為14%（圖2-B）。

圖1 不同KAH基因的編碼核酸序列同源性比對

圖 2 不同KAH基因的氨基酸序列比對

2.2 SrKAHs的表達模式分析

根據不同的KAH編碼序列的比對結果和定量引物設計優先選擇檢測的位置，7個不同的KAH基因在mRNA水平無法區分，因此在不同SrKAHs保守區域設計定量引物分別檢測在收獲期不同品種和苗期守田3號不同組織部位中所有KAH編碼基因的同時表達的水平。結果（圖3-A）顯示SrKAHs在江甜3號葉片中表達最高，其次是守田3號，譜星1號葉片中表達最低。不同組織部位表達檢測結果（圖3-B）顯示，SrKAHs在葉片中表達高于根系，莖中表達最低；SrKAHs在不同冠層葉片中表達差異也非常顯著，中葉中表達最高，底葉其次，頂葉表達最低。

2.3 不同KAH基因的進化分析

通過NCBI在線分析7個不同KAH基因的保守區域發現在它們的氨基酸序列中均包含細胞色素P450家族的保守區。將7個KAH基因的氨基酸序列與擬南芥中的P450家族基因核酸序列進行進化分析，結果（圖4）表明這7個KAH基因均與擬南芥中CYP716A亞家族進化關系最近。擬南芥中CYP716A亞家族已報道的共有兩個基因CYP716A1和CYP716A2，通過DNAMAN軟件分析確定7個KAH按照編號順序與CYP716A1的同源性依次為 44.50%、52.46%、46.67%、52.46%、48.42%、46.44%和46.90%，與CYP716A2的同源性依次為 44.27%、55.74%、47.71%、55.74%、50.18%、47.48%和47.94%（表1）。

2.4 不同KAH基因的亞細胞定位分析

通過在線軟件WoLF PSORT（http://wolfpsort. org/）對7個KAH基因的亞細胞定位分析，表格中數字越大代表基因定位到此細胞結構的可能性越大。結果（表2）顯示KAH3、KAH5、KAH6定位在葉綠體中；KAH2和KAH4定位在細胞質中；KAH1和KAH7可能定位在葉綠體也有可能定位在細胞外。

圖 3 SrKAHs表達模式

3 討論

圖4 甜葉菊不同KAH基因和擬南芥P450家族成員進化樹

貝殼杉烯酸脫氫酶（KAH）是甜菊糖苷和赤霉素生物合成途徑上的關鍵分支節點酶，不同KAH的活性決定下游系列產物的合成和積累［8，9］。自然進化與人工選育法獲得高糖苷積累甜葉菊品種的過程會造成基因信息的改變。因此本研究選擇不同甜葉菊品種分別克隆KAH編碼基因，然后通過研究分析這些序列結構特征、表達模式等預測其功能，試圖篩選具有高效底物轉化活性KAH的編碼基因并進一步揭示糖苷的積累差異的分子機制。通過對獲得不同SrKAHs核酸序列比對分析發現，這些序列高度同源，差異僅為不連續的個別堿基，說明這些品種雖然選育時間差異較大但或許來源同一原始種系。其中總糖苷含量最高的SR2葉片中擴增到3個高度同源的KAH編碼基因，總糖苷含量相對較低的守田3號中擴增到兩個高度同源的KAH編碼基因，總糖苷含量最低的譜星1號中僅存在一個KAH的編碼基因。經過氨基酸序列分析預測發現，這些核酸序列雖然高度同源但由于突變堿基的位置造成了ORF的位置和大小的改變。SR2的3個SrKAHs和守田3號的其中一個SrKAH均只有1個ORF編碼476個氨基酸序列，守田3號的另1個SrKAH基因存在兩個ORF分別編碼236和208個氨基酸。已有文獻報道收獲期的江甜3號總糖苷含量略高于守田3號，譜星1號總糖苷含量顯著低于這兩個品種［15］，定量PCR檢測3個品種甜葉菊中SrKAHs的表達水平發現總糖苷含量較高的江甜3號中SrKAHs表達也最高，總糖苷含量最低的譜星1號中其表達水平最低；但總糖苷含量與江甜3號無顯著差異的守田3號中SrKAHs的表達也顯著低于江甜3號。另外，甜菊糖苷主要積累在甜葉菊葉片中且苗期越靠近植株頂端的葉片中總糖苷積累越多［4］，不同組織中SrKAHs的表達結果顯示其在葉片組織中的表達也顯著高于莖和根系；但SrKAHs在中葉中的表達顯著高于底葉。綜上所述，不同甜葉菊品種中KAH編碼基因的數目和其編碼蛋白大小存在顯著差異；SrKAHs的表達水平與基因數目不存在正相關關系，但不同甜葉菊品種和同一植株不同組織之間，其表達水平可用于指示總糖苷的積累水平。因此我們推斷甜葉菊中存在多個KAH編碼基因且其編碼蛋白的大小導致其生物功能的差異，這可能是造成甜葉菊中總糖苷積累差異的原因之一。

表2 不同SrKAHs的亞細胞定位分析

基因結構決定基因的功能，對不同SrKAHs基因保守結構域的分析結果表明7個SrKAHs均含有細胞色素P450的結構域，與之前克隆成功的具有底物轉化活性的SrKA13H同屬于P450家族［14］，且有研究報道P450家族中存在參與萜類合成的亞家族基因［16］。細胞色素P450家族龐大，基因眾多，參與植物體多種生物途徑包括激素、色素等物質的生物合成過程［17，18］。為進一步明確這些基因的具體功能，將這7個KAH編碼基因與研究較為透徹的擬南芥P450家族進行進化分析，發現這7個SrKAHs均與其CYP716家族進化關系最近。分別與CYP716家族的兩個基因進行同源性分析并根據P450家族的分類命名規則［19，20］可知，KAH2和KAH4與CYP716A家族基因同源性高于55%，因此同屬于CYP716A亞家 族；KAH1、KAH3、KAH5、KAH6和KAH7均高于40%低于55%，因此屬于CYP716的新的亞家族。已有的研究報道中還未有關于CYP716家族基因的功能描述，但此家族基因目前僅在擬南芥中克隆發現［21］，說明此基因家族不是赤霉素生物合成的專有家族，那么很可能此家族基因在甜葉菊中參與甜菊糖苷的生物合成。最早研究報道KAH的是從甜葉菊葉綠體中純化得到的并驗證了其轉化活性［7］，但后續研究者根據其上游的催化酶KO的定位對之前結論提出質疑且認為KAH應定位在內質網或者細胞質中起催化作用［8］；而7個不同KAHase編碼基因的亞細胞定位分析結果顯示KAH2和KAH4定位在細胞質中，其他基因均定位在葉綠體中。由此推測葉綠體和細胞質中均可產生甜菊醇，且由不同的SrKAHs編碼不同的KAHase進行底物轉化。

新的KAH編碼基因的發現和功能分析預測進一步完善了甜菊糖苷生物合成機制的研究，這些基因均具備KAH編碼基因的保守結構域。但其實際底物轉化活性還需進一步將這些候選基因轉化入大腸桿菌、酵母等異源體系或者直接轉化入甜葉菊內源體系，通過檢測其對甜菊醇轉化為甜菊糖苷的活性等方法驗證。但這些新基因的克隆為獲得更高底物轉化活性基因的獲得和后續實現異源合成甜菊糖苷提供了候選基因。

4 結論

通過對不同甜葉菊材料中KAH編碼序列的克隆、序列及表達模式分析可知，既存在多個甜葉菊材料擁有一個相同的KAH編碼序列的情況，也存在一個甜葉菊材料擁有多個KAH編碼序列的情況，且這些編碼序列編碼氨基酸的長度差異可以導致其功能上的差異。SrKAHs的表達與編碼基因的數目和序列差異不存在相關性但可以用來指示甜葉菊糖苷積累水平。對這些存在差異的氨基酸序列分析可知雖同屬于P450家族但分屬于不同亞家族且在亞細胞結構中定位不同。綜上所述，在不同甜葉菊材料中KAH編碼序列的數目、長度和亞細胞定位等差異或許是造成基因表達和功能差異繼而導致總糖苷積累差異的原因之一。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of New KAH Genes from Stevia rebaudian

ZHU Jing-wen GUO Shu-qiao SHU Hong-mei GONG Yuan-yong JIANG Lu NI Wan-chao
（Institute of Industrial Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Science，Nanjing 210095）

This work is to further reveal the molecular mechanism of the biosynthesis of steviol glycosides（SGs）and analyze the reasons caused the different accumulation of SGs in stevia leaves. Different stevia materials were utilized to clone the coding genes of kaurenoic acid hydroxylase（KAH）at the key point of a branch pathway，and the biological function of the obtained nucleic acid sequences were analyzed and predicted. Finally six highly homologous nucleotide sequences were cloned. The key base mutations of nucleotide sequences caused significant differences in the location and size of the open reading frame（ORF），and totally 7 different KAH genes were identified. Both KAH1 and KAH2 were found in SR1，SR3，Xinfeng 3，Puxing 1 and Shoutian 3，KAH3 was cloned in Jiangtian 1 and Shoutian 3，KAH4 were found in Jiangtian 3，and KAH5，KAH6 and KAH7 all existed in SR2. Furthermore，SrKAHs showed the highest expression in stevia varieties and tissues with high accumulation of SGs. P450 conserved domains were in the all of them，and further evolution analysis and amino acid homology results showed that they belonged to the CYP716 family. And the predicted results of subcellular location showed KAH2 and KAH4 localized in cytoplasm while the other five were localized in the chloroplast. Differences of gene numbers，amino acid length and location in subcellular structures of KAH genes in Stevia maybe cause the different expressions and functions of SrKAHs，finally resulting the different accumulation of SGs.

Stevia rebaudiana；steviol glycosides；KAH；CYP716

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.014

2016-09-12

江蘇省農業三新工程［SXGC（2015）213］，江蘇省農業科學院科技服務項目［KF（16）1042］

朱靜雯，女，博士，研究方向：植物次生代謝物；E-mail：jingwenstudy@126.com

倪萬潮，男，碩士，研究方向：植物次生代謝物；E-mail：nwchao@aliyun2002.com